遗传性牙本质发育不良Ⅰ型牙囊干细胞成骨/成牙骨质分化能力的体外研究

摘要

背景与目的：
　　遗传性牙本质发育不良Ⅰ型（Dentin dysplasia typeⅠ，DD-Ⅰ）是一类牙根发育不良且牙本质矿化程度降低的一类常染色体显性遗传病，主要特征是牙根短小或缺如，髓腔完全或不完全闭锁，部分无龋牙根尖有阴影。目前对DD-Ⅰ主要集中在患牙超微结构的研究，且主要对牙本质异常进行描述，本课题组2010年采集了一个DD-Ⅰ家系，对先证者口腔及患牙病理检查发现，其患牙牙槽骨高度不足，牙骨质变薄。因此，本研究拟通过体外分离培养DD-Ⅰ家系先证者的牙囊干细胞(dental follicle stem cells，DFCs)，观察其生物特性及成骨/成牙骨质分化能力，从细胞生物学方面为DD-Ⅰ牙根发育病理机制寻找新的线索。
　　材料与方法：
　　第一部分 DFCs的体外分离培养及增殖能力的研究
　　1.拔除DD-Ⅰ型家系先证者及健康人根尖发育未完全的第三磨牙，并采用改良酶消化+组织块法分离培养DFCs，分别为DD-Ⅰ组和健康对照组，倒置显微镜下观察两组细胞形态;
　　2.采用免疫荧光检测抗波丝蛋白(VIM)、抗角蛋白(CK)来鉴定DFCs来源;
　　3.运用有限稀释法、MTT法检测两组DFCs克隆形成率和生长曲线;
　　第二部分 DFCs的成骨/成牙骨质分化能力的体外探究
　　1.对两组DFCs矿化诱导14d、21d、28d后，行茜素红染色观察体外矿化结节形成情况;
　　2.采用ALP染色（改良Gomori钙钴法）检测两组DFCs矿化诱导7d、14d、21d后的碱性磷酸酶活性;
　　3.从mRNA和蛋白水平检测矿化相关蛋白ALP、OCN、BSP、RUNX-2的表达来评估DFCs的成骨/成牙骨质能力。
　　结果：
　　1.倒置显微镜下观察，DFCs为典型的成纤维样细胞，呈长梭形，两极突起较长。两组DFCs形态相似，但是传代时间不同，一般DD-Ⅰ组传代需要约3-4d，而健康对照组则传代需约5-6天。
　　2.免疫荧光显示:两组DFCs的Vim(+)，CK(-)，说明细胞来源于间充质干细胞;
　　3.细胞克隆实验显示:DD-Ⅰ组DFCs克隆形成率约为12.5％，而健康对照组DFCs克隆形成率为10.5％;
　　4.MTT检测细胞生长曲线显示:两组DFCs生长曲线均呈“S”型;与健康对照组相比，DD-Ⅰ组DFCs从第3天开始增殖较快，且差异具有统计学意义（P＜0.05）;
　　5.矿化诱导14d后行茜素红染色显示:两组DFCs均可见橘红色钙化结节及黑色钙盐成分，但与健康对照组相比，DD-Ⅰ组DFCs中钙结节数量少，面积小，钙盐成分也减少。
　　6.ALP染色结果显示:DD-Ⅰ组和健康对照组ALP阳性细胞随着矿化诱导时间的增加而增加，且每个时间点中DD-Ⅰ组阳性细胞量均少于健康对照组。
　　7.荧光定量PCR结果显示:随着成骨诱导时间的增加，两组ALP、OCN、BSP、RUNX-2的表达逐渐升高;两组每个时间点相比，DD-Ⅰ组各基因表达量均比健康对照组低，且差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
　　8.Western blot结果显示:ALP、BSP、OCN、RUNX-2在诱导从第7天开始，两组成骨蛋白的表达量逐渐增加，且每个时间点相比，DD-Ⅰ组各蛋白表达量均比健康对照组低，且差异均具有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.采用“酶消化+组织块法”能成功培养出DD-Ⅰ型患牙的DFCs，且细胞形态基本正常，细胞独立生存及增殖能力较强;
　　2.DD-Ⅰ型患牙DFCs向成骨/成牙骨质分化能力降低，在牙根发育过程中可能会影响牙骨质和牙槽骨的形成不足，进而造成牙根发育不足。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 DD-Ⅰ型患牙DFCs体外分离培养及增殖能力的研究

1．材料和方法

2．结果

3．讨论

第二部分 DD-Ⅰ型DFCs的成骨分化能力的体外探究

1．材料与方法

2．实验结果

3．讨论

全文总结

参考文献

综述 干细胞技术在口腔医学中的研究进展

个人简历

致谢