瑞戈非尼(regorafenib)通过JAK/STAT3信号通路对肝细胞癌的作用及机制的研究

摘要

目的：
　　为探讨瑞戈非尼是否可通过JAK/STAT3信号通路影响肝癌细胞发生，发展及侵袭的作用机制，本研究中我们首先检测人肝细胞癌组织中STAT3蛋白，p-STAT3蛋白及STAT3mRNA的表达，分析它们与肝细胞癌发生及进展的关系，其次应用瑞戈非尼作用于2个原发性肝癌细胞株(LM3、HUH7)，观察它通过JAK/STAT3信号通路对肝细胞癌细胞株增殖、凋亡及侵袭的作用及其相关分子机制。并通过研究肝癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型及肺转移瘤模型，进一步探讨瑞戈非尼通过JAK/STAT3信号通路对肝癌细胞增殖、凋亡与侵袭中的作用及机制。本研究共分为以下三部分。
　　第一部分:STAT3在肝细胞癌中表达及其意义
　　方法：
　　1.采用免疫组织化学方法（Immunohistochemistry，IHC），免疫印迹法（Western blot）及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测78例人肝癌组织及50例肝癌癌旁组织中p-STAT3蛋白，STAT3蛋白及STAT3mRNA，表达情况。
　　2.统计学处理:应用SPSS19.0软件处理，采用x2检验、t检验和方差分析，检验水准α=0.05。
　　结果：
　　通过免疫组化，Western blot及RT-PCR检测发现:
　　1.免疫组化检测p-STAT3蛋白在肝细胞癌组织中的表达高于癌旁组织，两者间差异有统计学意义(p＜0.05)。Western blot检测STAT3癌组织和癌旁组织之间表达量没有显著性差异(p＞0.05)，p-STAT3癌组织和癌旁组织之间相比，癌组织表达量明显高于癌旁组织，两者之间具有显著性差异(p＜0.05)。RT-PCR检测结果表明，STAT3mRNA的表达在肝细胞癌组织和癌旁组织中没有显著性差异(p＞0.05)。
　　2.p-STAT3蛋白及STAT3mRNA的表达与肝细胞癌患者的年龄与性别差别无关(p＞0.05)。
　　3.p-STAT3蛋白及STAT3mRNA的表达量随着肝细胞癌细胞组织学分化程度的降低依次升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　4.p-STAT3蛋白及STAT3mRNA的表达量在肝细胞癌淋巴结转移患者中高于未转移的患者，差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　5.p-STAT3蛋白及STAT3mRNA的表达量随着肝细胞癌患者TNM分期的增高而依次升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　第二部分:瑞戈非尼对肝癌细胞的细胞生物学特征的影响及机制研究
　　方法：
　　1.通过Western blot实验来验证在4种HepG2、Hep3B、LM3、HUH7肝癌细胞株中JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3、MMP2和MMP9的表达情况。选择具有较高蛋白表达的两肿肝癌细胞株:LM3和HUH7做进一步研究。
　　2.将2种肝癌细胞株(LM3和HUH7)种植到96孔板中，通过MTT实验，设置0μmol/L、5μtmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L的瑞戈非尼浓度梯度来观察不同药物浓度对肝癌细胞系的抑制情况，找到药物IC50，采用该浓度进行后续的实验。设置0h、24h、48h、72h、96h五个时间梯度，观察瑞戈非尼用药前后对肝癌细胞细胞株的抑制情况。
　　3.通过克隆形成试验和EdU增殖试验检测瑞戈非尼用药前后对2种肝癌细胞株增殖的抑制作用。
　　4.通过流式细胞检测瑞戈非尼对肝癌细胞的周期和凋亡的影响，通过caspase3和caspase9凋亡试剂盒检测肝癌细胞的凋亡情况。
　　5.通过Transwell实验，检测瑞戈非尼用药前后对两种肝癌细胞株侵袭和迁移能力的抑制作用。
　　6.通过RT-PCR检测瑞戈非尼用药前后对2种肝癌细胞株JAK1、JAK2和STAT3mRNA的表达情况。
　　7.通过Western blot检测检测肝癌细胞株LM3及LM3-STAT3中瑞戈非尼用药前后JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、casepase3、cleaved-caspase3、caspase9、cleaved-caspase9、MMP2、MMP9蛋白的表达。
　　结果：
　　1.在4株肝细胞癌细胞株中，LM3和HUH7肝癌细胞株JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3、MMP2和MMP9的蛋白表达相对比较丰富。随后选择LM3和HUH7肝癌细胞株进行相关研究。
　　2.两株细胞(LM3和HUH7)经过不同浓度的瑞戈非尼:0μtmol/L、5μtmol/L、10μtmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L处理后发现，随着药物浓度的提高，瑞戈非尼对肝癌细胞株LM3和HUH7的生长抑制逐渐增强，呈剂量依赖关系，HUH7细胞株的IC50的浓度为9.887μmol/L(R2=0.9328)，LM3的IC50的浓度为9.914μmol/L(R2=0.9096)，选择10μmol/L作为药物处理浓度进行后续研究。10μtmol/L瑞戈非尼处理LM3和HUH7细胞，检测不同时间瑞戈非尼对细胞的抑制作用，结果表明在48h药物抑制作用最为明显。
　　3.通过克隆形成试验及EdU增殖实验发现:与对照组（未加药）相比，实验组（瑞戈非尼10μmol/L）肝癌细胞的增殖被明显抑制，在两种细胞系中组间差异均有统计学意义(p＜0.05)。
　　4.流式细胞学检测发现:与对照组（未加药）相比，实验组（瑞戈非尼10μmol/L）肝癌细胞发生G2/M期的周期阻滞，在两种细胞系中组间差异均有统计学意义(p＜0.05)。
　　5.通过流式细胞学检测发现:与对照组（未加药）相比，实验组（瑞戈非尼10μmol/L）肝癌细胞的凋亡明显的增强，在两种细胞系中组间差异均有统计学意义(p＜0.05)。
　　6.通过caspase3和caspase9凋亡试剂盒检测发现:与对照组（未加药）相比，实验组（瑞戈非尼10tμmol/L）肝癌细胞caspase3和caspase9活性增强，在两种细胞系中组间差异均有统计学意义(p＜0.05)。
　　7.通过Transwell实验检测发现瑞戈非尼可以抑制肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力，对照组（未加药）与实验组（瑞戈非尼10μmo1/L）相比差别有统计学意义(p＜0.05)。
　　8.通过RT-PCR检测在2种肝癌细胞株中对照组（未加药）与实验组（瑞戈非尼10μtmol/L）JAK1、JAK2和STAT3mRNA的表达情况没有差异性(p＞0.05)。
　　第三部分:瑞戈非尼在裸鼠肿瘤模型中的作用及机制研究
　　方法：
　　1.选取肝癌细胞株LM3及LM3-STAT3构建裸鼠皮下移植瘤模型。
　　2.比较裸鼠皮下移植瘤模型中实验组（瑞戈非尼）与对照组（生理盐水）肿瘤大小的差异;
　　3.选取肝癌细胞株LM3及LM3-STAT3构建裸鼠肺转移瘤模型。
　　4.比较裸鼠肺转移瘤模型中实验组（瑞戈非尼）与对照组（生理盐水）肿瘤数量的的差异;
　　5.通过免疫组织化学分析，裸鼠肿瘤模型中实验组（瑞戈非尼）与对照组（生理盐水）p-STAT3的表达情况。
　　6.经Western-Blot方法分析，裸鼠肿瘤模型中实验组（瑞戈非尼）与对照组（生理盐水）JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、MMP9和MMP2的表达情况。
　　结果：
　　1.与对照组相比，瑞戈非尼能够明显的抑制LM3皮下移植瘤模型组裸鼠肿瘤的大小，差异有显著性(p＜0.05)，瑞戈非尼处理组肺转移数目明显低于对照组(p＜0.05);LM3-STAT3模型组，STAT3过表达后可以明显抑制瑞戈非尼的作用。
　　2.通过免疫组织化学检测，在LM3皮下移植瘤模型中，与对照组相比，瑞戈非尼处理后的裸鼠肿瘤p-STAT3的表达降低，差异有显著性(p＜0.05)。在LM3-STAT3肿瘤模型中，与对照组相比，瑞戈非尼处理后的裸鼠肿瘤p-STAT3的表达量无差异(p＞0.05)
　　3.通过Western blot检测发现，在LM3肿瘤模型中，与对照组相比，瑞戈非尼处理后的裸鼠移植瘤组织中中JAK1、JAK2和STAT3表达量无差异(p＞0.05)，而p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3、MMP2和MMP9蛋白的表达均降低，差异有显著性(p＜0.05)。在LM3-STAT3皮下移植瘤模型中，与对照组相比，瑞戈非尼处理后的裸鼠肿瘤中JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3、MMP2和MMP9表达量无差异(p＞0.05)，而p-JAK1和p-JAK2和蛋白的表达均降低，差异具有显著性(p＜0.05)。
　　结论：
　　1.肝细胞癌组织中p-STAT3蛋白和STAT3mRNA的高表达与肝细胞癌的发生，发展，浸润及转移具有相关性。
　　2.瑞戈非尼可以抑制肝癌细胞株的增殖，迁移，侵袭，并促进凋亡。
　　3.体内外实验表明瑞戈非尼可以通过抑制JAK/STAT3信号通路中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3等蛋白磷酸化，调控caspase3和caspase9的活化，以及抑制MMP2和MMP9蛋白表达，进而抑制肝癌细胞增殖，迁移，侵袭并促进细胞凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩略词及中英文对照索引

引言

第一部分 STAT3在肝细胞癌组织中的表达及其意义

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 结论

参考文献

第二部分 瑞戈非尼对肝癌细胞的生物学特征及机制研究

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 结论

参考文献

第三部分 瑞戈非尼在裸鼠肿瘤模型中的作用及机制研究

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

6 结论

参考文献

全文结论

综述 肝细胞癌的研究进展

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢