新型电化学DNA生物传感器对牙菌斑样本幽门螺杆菌的检测

摘要

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是人体常见的致病菌之一，引发胃炎、胃溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤、胃癌等疾病。调查数据指出，世界上大约50％的人感染了Hp。可靠、快速地检测Hp，对于胃十二指肠疾病的临床监测和治疗，具有重要意义。牙菌斑是Hp的重要聚集地，与胃内的Hp有很高的相关性。因此建立一种灵敏、快速的牙菌斑样本Hp的检测方法，有望用于胃内Hp感染的无创诊断。
　　电化学DNA生物传感器具有简单、快速、灵敏、准确、特异、无颜色干扰和成本低等优点，已成为一种广泛应用于生理或生物样本的DNA检测的方法。金纳米颗粒(AuNPs)具有比表面积较大，生物相容性良好，电催化活性高，导电性好，理化性质稳定等优点，已成为制备灵敏的DNA生物传感器常用的纳米材料。
　　本研究组前期的工作已构建了一种新型的电化学DNA生物传感器，检测43ntHp UreB基因特异的DNA单链。该DNA生物传感器以发卡DNA作为生物条码修饰在金纳米颗粒上，五氨·3-（2-菲-9-甲基-乙烯基）吡啶合钌(Ⅱ)([Ru(NH3)5L]2+)为杂交指示剂。在高离子浓度下，[Ru(NH3)5L]2+复合物主要通过嵌入方式与DNA双链结合，从而降低背景信号。该传感器的最低检测极限为1飞摩尔（fM）。
　　基于此，本研究着力于将电化学DNA生物传感器方法应用于检测牙菌斑样本中的Hp。然而，牙菌斑中Hp的含量极低，浓度为飞摩尔(10-15M)甚至是阿摩尔(10-18M)。在电化学DNA生物传感器方法检测之前，需要对牙菌斑样本中Hp进行扩增。本研究根据Hp UreB基因的特异性序列设计得到一对19-20nt特异引物。通过菌落PCR技术获得目的片段，大小为104bp，包含Hp UreB基因中43bp的特异序列。
　　电化学DNA生物传感器用于检测单链DNA，而生理样本中的DNA和PCR扩增产物通常为DNA双链，难以直接检测。本研究设计了Blocker来释放靶DNA单链，Blocker与靶DNA单链的互补序列小部分碱基配对。电化学DNA生物传感器检测PCR扩增得到的目的片段时，在Blocker的作用下，对靶DNA双链进行热变性来释放含有43nt特异序列的104nt靶DNA单链。本研究组已构建的电化学DNA传感器可以捕获和检测释放的靶DNA单链。在Blocker浓度为10-7M，NaCl浓度为0.6M，复性时间为15min时，传感器灵敏度达到最佳。在最优的条件下，对不同浓度的靶DNA双链进行电化学检测，结果显示电化学信号与靶DNA双链浓度的对数在3.28×10-14M-6.55×10-12M范围内呈良好的线性，线性回归方程:Ip(μA)=3.27+0.24log[CdsDNA]（M)，R=0.9977，最低检测限为12fM。
　　本研究用该传感器对34名进行过13C尿素呼气试验患者的牙菌斑样本中Hp进行检测。与尿素呼气试验(UBT)结果对比，电化学方法的敏感性是100％，特异性是83.3％，说明本研究提出样品处理和电化学DNA传感方法可以灵敏而特异地检测牙菌斑生理样品，并且牙菌斑中的Hp与胃中Hp感染高度相关。
　　本研究成功构建了一种能对牙菌斑样本中Hp进行检测的电化学DNA生物传感器。在下一步的研究中，进一步提高电化学DNA生物传感器的灵敏度，以期实现对牙菌斑和其它非侵入性样品中Hp的无PCR扩增检测，最终实现对胃内Hp感染的非侵入性诊断。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 幽门螺杆菌的研究进展

1．1．1 幽门螺杆菌的生物学和流行病学特征

1．1．2 幽门螺杆菌的致病机制

1．1．3 口腔幽门螺杆菌与胃中幽门螺杆菌的相关性

1．2 幽门螺杆菌的检测方法

1．2．1 胃内幽门螺杆菌的检测方法

1．2．2 口腔幽门螺杆菌的检测方法

1．3 电化学DNA生物传感器

1．3．1 电化学DNA生物传感器基本原理

1．3．2 电化学DNA生物传感器的信号检测

1．3．3 电化学DNA生物传感器的应用

1．4 纳米金颗粒在电化学DNA生物传感器的应用

1．5 DNA扩增技术

1．4．3．1 PCR技术

1．4．3．2 等温扩增方法

1．5 本研究的目的意义及主要内容

1．5．1 研究课题的目的意义

1．5．2 主要研究内容

2 目的片段的扩增

2．1 前言

2．2 实验材料、试剂与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 菌落PCR方法扩增目的片段

2．3．2 链置换扩增方法扩增目的片段

2．4 结果与讨论

2．4．1 幽门螺杆菌(ATCC 43504)菌株的培养

2．4．2 PCR反应两对引物的对比

2．4．3 PCR反应引物特异性和重复性分析

2．4．4 链置换扩增产物的电泳结果

2．4．5 不同dNTP浓度链置换扩增产物的电泳结果

2．5 小结

3 构建电化学DNA生物传感器检测标准靶DNA双链

3．1 前言

3．2 实验材料、试剂与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 hpDNA-AuNPs-rpDNA复合物的制备

3．3．2 靶DNA单链的释放

3．3．3 电化学DNA生物传感器检测标准靶DNA双链

3．3．4 实验条件的优化

3．3．5 电化学DNA生物传感器的线性检测

3．3．6 电化学DNA生物传感器的重现性

3．4 结果与讨论

3．4．1 hpDNA-AuNPs-rpDNA复合物的制备

3．4．2 Blocker作用的探究

3．4．3 实验条件的优化

3．4．4 电化学DNA生物传感器的线性检测

3．4．5 电化学DNA生物传感器的重现性

3．4．6 与其他电化学DNA生物传感器检测性能的对比

3．5 小结

4 电化学DNA生物传感器检测牙菌斑样本的幽门螺杆菌

4．1 引言

4．2 实验材料、试剂与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 牙菌斑样本的采集及保存

4．3．2 菌落PCR方法对牙菌斑中幽门螺杆菌的检测

4．3．3 电化学DNA生物传感器对牙菌斑中幽门螺杆菌的检测

4．4 结果与讨论

4．4．1 菌落PCR方法与电化学DNA生物传感器方法的对比

4．4．1 电化学DNA生物传感器检测牙菌斑样本幽门螺杆菌

4．5 小结

5 结论

参考文献

个人简历

致谢