CB-5083联合顺铂通过调控内质网应激增强食管鳞癌的抗肿瘤作用

摘要

食管癌是一种复杂的消化道恶性肿瘤，是世界上第六大癌症死亡原因，主要有食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）两种病理分型。在中国，主要以食管鳞癌为主，并呈现明显的地理性差异分布，其发病率高，治病因素多样，且预后差，易发生转移。食管鳞癌的一线化疗大多采用含铂或以氟尿嘧啶为基础的方案，然而，传统化疗药物毒副作用大，严重影响患者生活质量，并且常常出现耐药现象，治疗失败后患者的中位生存时间不到1年，预后极差。靶向药物治疗的确切疗效已经在部分消化道肿瘤（如结直肠癌和胃癌）中得到很好的验证，但食管鳞癌尚无有效的分子靶向药物，相关研究还处于探索阶段。因此，寻找有效的新型靶向药物，探索下游信号通路，并分析靶向治疗与传统化疗药物联用的潜在价值，将有望为食管鳞癌的治疗提供新思路。 p97是三磷酸腺苷超家族中的一员，在细胞中广泛存在，参与了多种重要的细胞生物学过程，包括蛋白质稳态调控、自噬、染色质重塑、转录活性调节、免疫信号传导等。研究表明,p97能够通过辅助降解细胞内大量错误折叠蛋白，参与胞内蛋白质质量控制，保证细胞在蛋白质毒性压力下的存活。p97作为蛋白质量控制的关键组分，已成为抗癌靶向治疗的研究热点。研究表明，p97在非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中高表达，且多与肿瘤浸润程度、组织学类型、病理分期等密切相关。抑制p97蛋白活性，能显著抑制非小细胞肺癌、结直肠癌、浆细胞癌等多种肿瘤的增殖。目前，针对p97抑制剂的筛选工作也已取得一定突破，DBeQ、NMS-873和CB-5083等抑制剂被相继报道。然而p97在食管鳞癌中的作用尚未引起关注，相关的文献报道较少。 据此，本研究旨在从体内外水平研究p97抑制剂CB-5083单独或联合顺铂对食管鳞癌的抗肿瘤作用，并结合临床组织分析，阐明p97作为食管鳞癌治疗靶点的潜在价值，为食管鳞癌的化学治疗提供新思路和科学依据。 方法： 第一部分：CB-5083对食管鳞癌细胞表型及内质网应激途径的影响 1.食管鳞癌组织和细胞中p97的表达情况 收集临床手术切除的食管鳞癌组织及癌旁正常组织标本，qRT-PCR和免疫组织化学法检测临床标本中p97mRNA和蛋白的表达，并采用qRT-PCR和Western blot检测食管鳞癌细胞中p97mRNA和蛋白的表达。 2.p97抑制剂对食管鳞癌细胞表型及内质网应激途径的影响 选取3种p97抑制剂，CCK-8法筛选出其中对食管鳞癌细胞生长抑制作用最为显著的抑制剂（CB-5083），并明确其对食管鳞癌细胞的最适作用时间及浓度范围进行后续实验。EdU荧光法检测CB-5083对食管鳞癌细胞增殖的影响，FITC/PI双染法检测CB-5083对食管鳞癌凋亡的影响，流式细胞仪检测CB-5083对食管鳞癌细胞周期的影响，Transwell检测CB-5083对食管鳞癌细胞迁移的影响，Western blot检测CB-5083对癌细胞内质网应激途径相关蛋白表达的影响。 第二部分：CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞表型的影响 EdU荧光法检测CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞增殖的影响，FITC/PI双染法检测联合用药对食管鳞癌细胞凋亡的影响，流式细胞仪检测联合用药对食管鳞癌细胞周期的影响，Transwell检测联合用药对食管鳞癌细胞迁移的影响，Western blot检测联合用药对食管鳞癌内质网应激途径相关蛋白表达的影响。 第三部分：体内实验研究CB-5083联合顺铂对食管鳞癌的抗肿瘤作用 裸鼠随机分为四组，皮下注射食管鳞癌Eca109细胞，构建裸鼠移植瘤模型。待裸鼠移植瘤长到适合体积时，将荷瘤裸鼠随机分为四组（NC对照组、CB-5083组、顺铂组、CB-5083+顺铂组），进行给药治疗，每隔1d测量裸鼠移植瘤的长、短径及裸鼠体重，绘制肿瘤生长曲线。4周后处死裸鼠并剥离移植瘤称重，计算移植瘤体积及抑制率。TUNEL法检测各组移植瘤组织中细胞凋亡情况，免疫荧光检测移植瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白表达。 结果： 第一部分：CB-5083对食管鳞癌细胞表型及内质网应激途径的影响 1.p97在食管鳞癌组织和细胞中的表达 在qRT-PCR检测的32对食管鳞癌组织样本中，22对食管鳞癌组织p97mRNA表达量显著高于癌旁正常组织；对另外30对食管鳞癌样本的免疫组化学检测结果发现p97高表达与食管鳞癌病理分级正相关；此外，与正常食管上皮细胞Het-1A相比，TE13、TE1、Eca109、Kyse70、EC9706细胞中p97蛋白表达明显上调，EC1细胞表达没有显著性差异。 2.p97抑制剂对食管鳞癌细胞表型及内质网应激途径的影响 选取p97抑制剂DBeQ、NMS-873和CB-5083，CCK-8法检测发现其中CB-5083对食管鳞癌细胞生长的抑制作用更显著。采用3个浓度梯度的CB-5083分别处理食管鳞癌细胞Eca109、Kyse70、TE1，结果发现随着药物浓度的增加，食管鳞癌细胞的增殖被明显抑制，细胞凋亡率逐渐上升，细胞周期被阻遏在G0/G1期，且细胞迁移率下降。此外，CB-5083作用后，食管鳞癌细胞中内质网应激相关蛋白p-EIF2α、PERK、Bip、Chop随着浓度的增加明显上调。 第二部分：CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞表型的影响 CCK-8结果显示，CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞生长的抑制作用具有协同效应。与CB-5083或顺铂单独用药组相比，联合用药组对食管鳞癌Eca109细胞增殖和迁移的抑制作用、对细胞凋亡的促进作用、对细胞周期的阻遏作用均更加显著。此外，联合用药组中内质网应激相关蛋白表达变化更为明显。 第三部分：体内实验研究CB-5083联合顺铂对食管鳞癌的抗肿瘤作用 裸鼠移植瘤实验结果表明，与对照组相比，CB-5083能够抑制裸鼠移植瘤的生长，而与单独用药组相比，联合用药组中移植瘤体积明显偏小，凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值下调更为显著；且细胞凋亡数增多。 结论： 1.与癌旁正常组织相比，食管鳞癌组织中p97mRNA和蛋白表达明显上调，且p97蛋白表达与食管鳞癌病理分级正相关。 2.p97抑制剂CB-5083能明显抑制食管鳞癌细胞的增殖和迁移，促进食管鳞癌细胞凋亡，并将细胞周期阻遏在G0/G1期，CB-5083能显著上调内质网应激相关蛋白的表达。结果表明，CB-5083能够通过促进内质网应激途径抑制食管鳞癌细胞增殖，并促进其凋亡。 3.与单独用药组相比，CB-5083与顺铂联合用药组能更显著的抑制食管鳞癌Eca109细胞的增殖和迁移，促进Eca109细胞的凋亡，并导致细胞周期紊乱。 4.体内研究表明，CB-5083治疗组裸鼠移植瘤略小于对照组，而CB-5083与顺铂联合用药组对实体瘤的生长抑制作用更加显著。结果表明，CB-5083能够与顺铂发挥协同抗肿瘤作用。

目录

声明

英文缩略词

引言

第一部分 CB-5083对食管鳞癌细胞表型及内质网应激途径的影响

前言

1.1材料与方法

1.1.1主要试剂及设备

1.1.2 主要仪器及设备

1.1.3细胞株

1.1.4细胞复苏、培养与冻存

1.1.5 CB-5083、DBeQ和NMS-873的配制

1.1.6 免疫组织化学检测组织样本中蛋白表达

1.1.7 qRT-PCR检测mRNA表达

1.1.8Western blot检测蛋白表达

1.1.9 CCK-8法检测细胞存活率

1.1.10 EdU检测细胞增殖

1.1.11 FITC/PI双染法检测细胞凋亡

1.1.12 流式细胞仪检测细胞周期

1.1.13 Transwell小室法检测细胞迁移

1.2 结果与分析

1.2.1 p97在食管鳞癌组织及细胞中的表达

1.2.2 p97在食管鳞癌细胞中的表达

1.2.3 p97蛋白抑制剂对食管鳞癌细胞生长的影响

1.2.4 CB-5083对食管鳞癌细胞增殖的影响

1.2.5 CB-5083对食管鳞癌细胞凋亡的影响

1.2.6 CB-5083对食管鳞癌细胞周期的影响

1.2.7 CB-5083对食管鳞癌细胞迁移的影响

1.2.8 CB-5083对食管鳞癌细胞内质网应激相关蛋白表达的影响

1.3讨论

1.4 小结

第二部分 CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞表型的影响

前言

2.1材料与方法

2.1.1 主要仪器及试剂

2.1.2 细胞培养、复苏与冻存

2.1.3 CCK-8法检测细胞存活率

2.1.4 EdU细胞增殖检测

2.1.5 FITC/PI双染法检测细胞凋亡

2.1.6 流式细胞仪检测细胞周期

2.1.7 Transwell小室法检测细胞迁移

2.1.8Western blot检测蛋白表达

2.2 实验结果与分析

2.2.1 CB-5083联合化疗药物对食管鳞癌细胞存活率的影响

2.2.2 CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞增殖的影响

2.2.3 CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞凋亡的影响

2.2.4 CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞周期的影响

2.2.5 CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞迁移的影响

2.2.6 CB-5083联合顺铂对食管鳞癌细胞内质网应激相关蛋白表达的影响

2.3 讨论

2.4小结

第三部分 体内实验研究CB-5083联合顺铂对食管鳞癌的抗肿瘤作用

前言

3.1材料与方法

3.1.1主要仪器及试剂

3.1.2 试剂配置

3.1.3 细胞株及裸鼠

3.1.4 裸鼠人食管鳞癌移植瘤的建立

3.1.5 裸鼠分组

3.1.6 给药方式

3.1.7 肿瘤体积测量

3.1.8 免疫荧光法检测蛋白表达

3.1.9 TUNEL法检测肿瘤组织凋亡

3.2 结果与分析

3.2.1 联合用药对裸鼠人食管鳞癌移植瘤生长的影响

3.2.2 免疫荧光法检测移植瘤组织中凋亡相关蛋白表达

3.2.3 TUNEL法检测肿瘤组织凋亡

3.3讨论

3.4小结

结论

参考文献

综述:p97 蛋白生物学功能研究进展

个人简历

致谢