低氧对棕色田鼠和布氏田鼠脑Epo/Epor基因表达影响的比较研究

摘要

氧在维持有机体的生存和新陈代谢等生命活动中常常发挥重要的作用，当有机体暴露于低氧环境时会产生一系列应答反应，如代谢紊乱、系统和组织损伤等。生活在高海拔或地下洞道中等缺氧环境中的动物，其形态、生理、和行为等方面发生了一系列改变来适应低氧环境，使身体各系统能够适应低氧环境。促红细胞生成素（Erythropoietin Epo）及其受体（Erythropoietin receptor Epor）主要作用是促进红系祖细胞的增值和分化，红细胞的成熟以及神经保护和神经营养等。 棕色田鼠（Lasiopodomys mandarinus）作为典型的地下鼠，长期生活在地下洞道缺氧环境中，近缘物种布氏田鼠（L.brandtii）是一种地面鼠，两者同属毛足田鼠属（Lasiopodomys）。目前有关地下鼠和地面鼠Epo/Epor基因在不同脑区中的神经保护作用研究较少。 因此，本研究采用比较生物学方法，以棕色田鼠为对象，布氏田鼠为对照，克隆两种田鼠的Epo/Epor基因并对其适应性进化研究，然后在实验室低压氧舱内模拟不同低氧环境，利用原位杂交技术手段，测定两种田鼠不同脑区内Epo/Epor基因表达差异，旨在揭示地下鼠Epo/Epor基因在低氧环境中的适应性进化和Epo/Epor基因对棕色田鼠低氧应激时的神经保护作用，为地下鼠的低氧适应机制提供理论基础。 主要研究结果如下： 1）布氏田鼠和棕色田鼠Epo/Epor基因的克隆布氏田鼠和棕色田鼠Epo/Epor基因长度均相同，Epo基因为590bp，Epor基因为1583bp。 2）布氏田鼠和棕色田鼠Epo/Epor基因适应性进化Epo/Epor基因系统进化树与Cyt b进化树拓扑结构一致，地下鼠中无趋同进化现象，棕色田鼠和布氏田鼠在系统进化树中共聚一支；Epo/Epor基因在进化中均呈净化选择，盲鼹鼠Epor基因存在适应性进化位点，位于胞浆区近末端(P=0.03)的462-S、467-G发生位点突变；棕色田鼠Epo/Epor基因上均未检测出正选择位点。 3）低氧对布氏田鼠和棕色田鼠脑组织中Epo/Epor基因表达的影响在不同的低氧暴露强度下，布氏田鼠和棕色田鼠海马体Epo/Epor基因均随O2浓度的下降呈上升趋势（布氏：P Epo=0.001，P Epor＜0.01；棕色：P Epo=0.001；P Epor＜0.01）；在低氧（10%）暴露不同时间阶段下：布氏田鼠海马体中Epo基因在24h表达量最高，在48h时间点上表达量下降（P=0.031）；但Epor基因表达量随时间的增加呈现升高趋势（P＜0.01）；棕色田鼠海马体中Epo/Epor基因表达量均随时间变化增高（P Epo＜0.001；P Epor＜0.001）。 在不同低氧暴露强度下，棕色田鼠和布氏田鼠大脑皮质中Epo/Epor基因表达量均随O2浓度的下降呈升高趋势（布氏：P Epo=0.025;P Epor=0.004；棕色：P Epo=0.034；P Epor=0.001）；在低氧（10%）暴露不同时间阶段下，布氏田鼠大脑皮质Epo基因的表达量随时间增加而升高（P=0.012）；而Epor基因在24h的表达量最高，在48h时表达量下降（P＜0.001）；棕色田鼠大脑皮质Epo/Epor基因的表达量均随时间而呈现上升的趋势（P Epo＜0.001；P Epor＜0.001）。 在不同低氧暴露强度下，布氏田鼠杏仁核Epo/Epor基因表达量随O2浓度的下降呈现上升趋势（P Epo=0.001；P Epor=0.001）；而棕色田鼠杏仁核中Epo/Epor的表达量在10%O2浓度下最高，在5%O2浓度条件下，Epo/Epor表达量均下降（P Epo=0.082；P Epor=0.087）；在低氧（10%）暴露不同时间阶段下，布氏田鼠杏仁核中Epo基因在24h的表达量最高，而在48h表达量下降（P＜0.001），Epor基因表达量随时间增加呈现上升趋势（P＜0.001），棕色田鼠杏仁核Epo/Epor基因在均24h的表达量最高，在48h时间点呈现下降趋势（P Epo=0.002；P Epor＜0.001）。 主要结论： 棕色田鼠和布氏田鼠的Epo/Epor基因未出现正选择进化。棕色田鼠对低氧有较强的适应，Epo/Epor基因具有较好的神经保护作用，不同脑区的神经保护机制不同，海马体和大脑皮质的神经保护机制较强，而杏仁核的神经保护机制较弱。

目录

声明

1 概述

1.1 地下鼠对低氧的适应性进化

1.2 Epo的结构与功能

1.3 Epor的结构与功能

1.4 研究目的和意义

1.5 研究内容

2 棕色田鼠和布氏田鼠Epo/Epor基因的克隆

2.1 引言

2.2 研究方法

2.2.1 研究对象

2.2.2 研究器材和试剂

2.2.3 棕色田鼠和布氏田鼠总RNA的提取。

2.2.4 RNA完整性

2.2.5 逆转录

2.2.6 引物合成

2.2.7 PCR扩增反应体系

2.2.8 PCR反应产物检测和测序

2.3 结果

2.3.1 RNA的提取

2.3.2 Epo/Epor基因PCR的扩增。

2.3.3 Epo/Epor基因序列的验证

2.4 讨论

3 Epo/Epor基因的适应性进化

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 分析方法

3.3 结果

3.3.1 Epo/Epor基因的系统发育树分析

3.3.2 Epo/Epor基因选择压力分析

3.3.3 氨基酸结构与正选择位点功能域分析

3.4 讨论

3.4.1 Epo/Epor基因的系统发育

3.4.2 Epo/Epor基因的进化选择

4 低氧对脑Epo/Epor基因表达的影响

4.1 引言

4.2 研究方法

4.2.1 研究对象

4.2.2 实验仪器与试剂

4.2.3 低氧处理

4.2.4.原位杂交引物的设计

4.2.5 切片的制作流程及染色方法

4.2.6 实验数据处理与分析

4.3 结果

4.3.1 低氧对海马体Epo/Epor基因表达的影响

4.3.2 低氧对大脑皮质Epo/Epor基因表达的影响

4.3.3 低氧对杏仁核Epo/Epor基因表达的影响

4.4 讨论

4.4.1 低氧对布氏田鼠和棕色田鼠海马体Epo/Epor基因表达的影响

4.4.2 低氧对布氏田鼠和棕色田鼠大脑皮质Epo/Epor基因表达的影响

4.4.3 低氧对布氏田鼠和棕色田鼠杏仁核Epo/Epor基因表达的影响

5 全文总结

5.1 研究的主要内容和结果

5.2 主要结论

6 文献综述

参考文献

致谢