基于ISSR和ITS的木犀属植物亲缘关系及系统分类研究

摘要

木犀属(Osmanthus)隶属于双子叶植物纲玄参目的木犀科(Oleaceae)，该属植物共31种，除北美洲特产2种，东南亚特产2种，日本特产1种外，中国分布有26种，占本属全部种类的84％，其中，中国特产21种。对于木犀属植物的分类研究以及从微形态、孢粉学、区系地理、细胞学、生理生化方面取得了进展，但是还存在较多问题，如种系不清、缺少分子水平的分类证据、存在疑问较多等。 本研究通过ISSR分子标记以及ITS序列分析技术从分子水平上研究了木犀属植物种间亲缘关系及木犀属的系统分类问题，为该属植物的种质资源保护、杂交育种和开发利用提供理论依据和参考数据，并为编写木犀属专志提供基础资料。主要结果如下： 1、本文首次获得16种木犀属植物的ITS序列，并在GenBank上进行注册，注册序列号分别为：EF362761、EF199709、EF362765、EF362758、EF362762、EF362768、EF362759、EF362764、EF362766、EF362760、EF362767、EF362770、EF362769、EF409350、EF362771和EF362772。桂花的ITS序列前人已有研究，但本研究所得到的序列与前人研究稍有不同，注册序列号为EF362763。 2、本文首先发现木犀属植物ITS序列长度为614-619bp，其中ITS-1为236-239bp，ITS-2为214-217bp，5.8S均为163bp；ITS-1的G+C含量范围为54.24-64.56％，ITS-2的G+C含量范围为54.63-63.43％，ITS的G+C含量范围为53.98-61.20％；ITS-1有94个变异位点，47个信息位点，ITS-2有92个变异位点，47个信息位点，5.8S有12个变异位点，3个信息位点。ITS序列存在多态性。 3、利用ITS序列所得聚类结果将所研究的17个种分成三类，美洲木犀为第一类，野桂花和狭叶木犀聚在一起为第二类，其它14个种为第三类。这与传统分类学观点不太一致。 4、本文首次将ISSR分子标记用于木犀属的系统分类研究。筛选出20条ISSR引物对17种木犀属植物进行扩增，共扩增出361条谱带，其中多态性条带344条，多态性谱带比率为95.29％，说明木犀属植物种之间存在较丰富遗传多样性。ISSR聚类结果与传统分类学观点有出入，但支持传统分类学关于种间关系的论述。 5、木犀属ITS序列聚类结果与ISSR标记聚类结果有不少互相印证的地方，说明从分子水平上对木犀属植物开展系统分类学研究是可行的、有效的。 6、建立了木犀属植物ISSR的反应程序及反应体系。反应程序为：95℃预变性5min，进入38个循环(94℃变性1min，52-55℃复性1min，72℃延伸2min)，最后于72℃延伸8min。扩增反应总体积为25 μ1，包括：1×Taq酶扩增缓冲液，2.0mmol/L Mg<'2+>，0.4μ mol/L引物，200 μ mol/L dNTP，20-100ng模板DNA和0.5U-1.0U TaqDNA聚合酶。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1前言

1.1木犀属植物概述

1.2木犀属植物研究概况

1.2.1传统分类学

1.2.2细胞学

1.2.3孢粉学

1.2.4分子生物学

1.2.5生理生化

1.2.6微形态和果实特征

1.2.7区系地理学研究

1.2.8木犀属与木犀科其它属的亲缘关系

1.3 ISSR分子标记的原理及其在被子植物研究中的应用

1.3.1 ISSR分子标记的原理

1.3.2 ISSR分子标记在被子植物研究中的应用

1.4 nrDNA ITS的特点及其在被子植物系统学研究中的应用

1.4.1 nrDNA ITS的结构特点

1.4.2 nrDNA ITS区长度和序列的变化

1.4.3 nrDNA ITS序列在被子植物系统学研究中的应用

2立题依据和研究意义

3材料与方法

3.1材料

3.1.1植物材料

3.1.2菌株和载体

3.1.3引物

3.1.4主要仪器设备

3.1.5主要试剂及试剂盒

3.1.6研究常用溶液配方

3.2方法

3.2.1 ISSR分子标记

3.2.2 ITS研究

4实验结果

4.1 ISSR结果

4.1.1 DNA的提取结果

4.1.2 ISSR反应体系的优化

4.1.3引物的筛选结果

4.1.4 PCR扩增结果

4.1.5种间遗传距离

4.1.6 UPGMA聚类结果

4.2 ITS结果

4.2.1 PCR扩增结果

4.2.2 PCR产物直接测序结果

4.2.3克隆测序结果

4.2.4 ITS序列特点

4.2.5聚类结果

5讨论

5.1 ISSR

5.1.1 ISSR反应体系的建立

5.1.2木犀属植物遗传多样性评价

5.1.3与传统分类学观点的比较

5.1.4种间亲缘关系

5.1.5 ISSR标记用于木犀属植物亲缘关系研究的可行性

5.2 ITS

5.2.1 ITS的长度和碱基组成

5.2.2突变和缺失热点

5.2.3三个聚类结果比较

5.2.4聚类结果与传统分类学的比较

5.2.5 ITS个体内的多态性现象

5.2.6 ITS区域用于木犀属植物亲缘关系的可行性

5.2.7 DNA的纯度及完整性

5.2.8 PCR 反应

5.2.9 PCR产物回收克隆测序

5.3 ISSR和ITS聚类结果的比较

5.4展望

6结论

参考文献

在读期间发表的论文

致谢