4株降酚细菌的鉴定及对芳香化合物降解特性研究

摘要

本研究对焦化厂污水处理曝气池泥样中分离出具有降解苯酚能力的细菌AW28、SW34、UW7、ZW12菌株,采用多相分类的方法,对其进行个体形态,菌落形态进行描述,检测其生理生化指标,采用遗传型分类,扩增其16SrDNA序列,测定G+Cmol％值,在种属水平上作出分类鉴定,并研究了其系统发育进化。扩充并丰富了我国的菌种资源以及基因资源,也进一步展示了苯酚降解菌的遗传进化现状和系统发育状况。然后,考察了四株菌对苯酚和其他芳香化合物的降解特性。
　　 结果：显示,AW28菌株个体形态杆状,G-杆菌,兼性厌氧,过氧化氢酶和氧化酶阳性,不能利用苷露醇等,进行双岐式检索表明该菌株属于邻单胞属(Plesiomonas)。通过对AW28菌株的16S rDNA序列测定及系统发育分析,结果显示AW28菌株为邻单胞菌属(Plesiomonas)类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides strain AW28)。该菌株16SrDNA基因序列已被Genbank收录,登录号为GU324301。AW28在28℃～37℃之间能够较好地生长和有效地分解苯酚,降解苯酚的最适代谢温度为37℃,最适生长pH7.0,对2.5g/L以下的苯酚能够有效降解,对低于起始浓度为3.5g/L的苯酚有较强的耐受能力。pH7.0,30℃,160rpm,培养72小时后,可降解675.5mg苯胺。
　　 SW34菌株G+菌,好氧,有球杆周期状变化,进行双岐式检索后初步鉴定该菌株属于放线菌目(Actinobacteria)。通过对SW34菌株的16S rDNA序列测定及系统发育分析,表明该菌为短杆菌属(Brevibacterium)的表皮短杆菌(Brevibacterium epidermidis strainSW34),该菌株16S rDNA基因序列己被Genbank收录,登录号Gu576981。30℃时,菌株的生长和苯酚降解均达到峰值。最适生长pH为7.0,耐弱碱。当起始苯酚浓度低于1.0g/L时,培养24h苯酚被快速降解;当起始苯酚浓度提高到1.5g/L时,48h时降解率可达到100％。对苯酚浓度在2.5g/L的培养液72h后降解率可达70％。对低于起始浓度为3.5g/L的苯酚有较强的耐受能力。pH7.0,30℃,160rpm,培养72小时后,可降解791.4mg苯胺。
　　 UW7菌株个体形态为杆状,革兰氏呈阴性结果,无蔗糖酶,淀粉酶,脂肪酶,利用柠檬酸盐,接触酶反应呈阴性,氧化酶反应呈阳性,琼脂穿刺结果呈阴性,明胶液化为阴性结果。根据形态、生理生化性状初步鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter)。通过16S rDNA序列测定和同源性分析,该菌株被进一步鉴定为鲁氏不动杆菌(Acinetobacterlwoffii strain UW7),该菌株16S rDNA基因序列已被Genbank收录,登录号GU083586。这是关于具有降解苯酚能力的鲁氏不动杆菌分离和研究的首次报道。该菌株降解苯酚的最适代谢温度为30℃,最适生长pH7.0,对2.5g/L浓度的苯酚能够有效降解,对3.5-4.0g/L浓度的苯酚有较强的耐受能力。pH7.0,30℃,160rpm,培养72小时后,可降解795.3mg苯胺。
　　 ZW12菌株化能异养,G-,杆状,好氧,不发酵,接触酶实验为阳性结果,氧化酶实验为阴性结果。测定ZW12菌株G+C mol％为65.2％,Diaphorobacter属模式菌株的G+C mol％含量为66.0％。通过16S rDNA序列测定和同源性分析,ZW12菌株被鉴定为Diaphorobacter属细菌。该菌株16S rDNA基因序列已被Genbank收录,登录号为GU576982。Diaphorobacter还是个新的细菌属,还有很多菌种有待发现,鉴于ZW12独特的生理生化特征以及其苯酚降解特性,建议将其列为新的菌种。ZW12菌株的最适苯酚降解温度为28℃-33℃,最适pH为7.0-9.0,耐弱碱,对环境适应能力较强,对苯酚耐受力可达4.0g/L。30℃,160rpm,培养72小时后,可降解803.1mg苯胺。ZW12菌株对于完善Diaphorobacter属细菌种类有重要价值,其特殊的生理特性也使其具有较大的经济价值。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 酚废水污染的现状及危害

1.2 酚污染的治理对策

1.2.1 物理化学法

1.2.2 化学法

1.2.3 生物法

1.3 微生物降解苯酚的途径以及酚降解菌种类

1.3.1 苯酚降解菌的降解途径

1.3.2 苯酚降解菌的种类

1.4 多相分类学鉴定

1.4.1 表型分类法

1.4.2 分子遗传型分类法则

1.5 选题依据和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 样品来源

2.1.2 菌株

2.1.3 培养基

2.1.4 酶与主要生化试剂

2.1.5 测定苯酚浓度用试剂的配制

2.1.6 测定苯胺浓度用试剂的配制

2.1.7 分子生物学分析所用试剂的配制

2.1.8 常用染液和溶液的配制

2.1.9 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 菌株表型鉴定

2.2.2 苯酚测定方法

2.2.3 苯胺测定方法

2.2.4 苯酚降解菌的降解曲线

2.2.5 DNA提取及纯化方法

2.2.6 16S rDNA的PCR扩增

2.2.7 系统发育树构建

2.2.8 G+C mol%的测定

3 结果与讨论

3.1 AW28高效苯酚降解菌的鉴定及降解特性

3.1.1 AW28菌株的形态及生理生化特征

3.1.2 AW28菌株16S rDNA序列测定及系统发育分析

3.1.3 AW28菌株降解苯酚特性

3.1.4 AW28菌株对苯胺的降解

3.2 SW34菌株高效苯酚降解菌的鉴定及降解特性

3.2.1 SW34菌株的形态及生理生化特征

3.2.2 SW34菌株16s rDNA序列测定及系统发育分析

3.2.3 SW34菌株降解苯酚的特性

3.2.4 SW34菌株对苯胺的降解

3.3 UW7菌株高效苯酚降解菌的鉴定及降解特性

3.3.1 UW7菌株的形态及生理生化特征

3.3.2 UW7菌株16S rDNA序列测定及系统发育分析

3.4.3 UW7菌株降解苯酚特性

3.3.4 UW7菌株对苯胺的降解

3.4 ZW12菌株高效苯酚降解菌的鉴定及降解特性

3.4.1 ZW12菌株的形态及生理生化特征

3.4.2 ZW12菌株G+C mol%含量测定

3.4.3 ZW12菌株16SrDNA序列测定及系统发育分析

3.4.4 ZW12菌株降解苯酚特性

3.4.5 ZW12菌株对苯胺的降解

4 结论

参考文献

致谢

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