豹蛙抗瘤酶及其融合蛋白的毕赤酵母表达、中试、分离纯化与结构-活性相关性研究

摘要

豹蛙抗瘤酶(onconase，ONC)是一种新型抗癌药物，对多种实体瘤有很强的杀伤作用，是首个进入抗肿瘤临床试验的核糖核酸酶，也是当前全球重点研究的100种新药之一。目前临床使用的ONC均为天然ONC，提取过程繁琐，来源受限，无法大规模应用，利用生物工程技术制备重组ONC(recombinant ONC，rONC)已经取得一些进展，但获得的rONC仍存在表达量低和活性不高等问题。
　　本论文首次将 HSA与 ONC进行融合表达，利用重组人血清白蛋白(recombinant human serum albumin，rHSA)的高表达特性及酵母的密码子偏好性，同时考虑到连接肽是否插入以及连接肽的不同长度可能影响融合蛋白的结构进而影响其功能，设计4种长度的连接肽，连接肽以Gly4Ser1为模体进行重复，重复数量分别为0、1、2和3，构建融合蛋白基因序列，简称HSA-M(0,1,2,3)-ONC。对ONC及HSA-M(0,1,2,3)-ONC基因序列进行优化（糖基化位点突变、GC含量提高、偏好密码子、信号肽等），构建5种基因的7种载体-宿主菌组合并进行了筛选，并对rONC及其融合蛋白的发酵、中试放大以及纯化过程中亟需解决的关键技术进行了研究，获得了高纯度和高活性的rONC及其融合蛋白。主要内容包括：
　　(1) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的高效表达毕赤酵母工程菌的构建及筛选：优化ONC及HSA-M(0,1,2,3)-ONC基因序列，构建ONC及HSA-M(0,1,2,3)-ONC毕赤酵母表达载体，分别转入3种宿主菌（X-33、GS115和SMD1168），对得到的7种载体-宿主组合进行诱导表达，筛选得到rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC高表达菌株。结果表明，5种外源蛋白在pPICZα-A/X-33组合表达水平均高于pPIC9/GS115、pPIC9K/GS115、pPICZα-A/GS115，均显著高于pPIC9/SMD1168、pPIC9K/SMD1168、pPICZα-A/SMD1168组合。
　　(2) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的表达条件优化：本研究对pH、诱导温度、培养基以及甲醇浓度等条件进行了优化，结果表明rONC在1 L摇瓶规模的最佳表达pH为5.5，最佳诱导温度为23℃；在3 L规模条件下，最佳培养基为低盐基础培养基（lower basic salt medium，LBSM），最佳诱导甲醇浓度为0.25％，rONC诱导7 d时表达量最高（155.0mg/L）；在1 L摇瓶规模下，rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的最佳pH依次为6.5、7.0、7.0和7.0，最佳诱导温度均为23℃；在3 L发酵规模条件下，最佳培养基为LBSM，最佳诱导甲醇浓度为0.25%，诱导10 d时rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的表达量最高，分别为1.65、1.53、1.37和1.52 g/L。
　　(3) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的中试放大：在3L规模基础上，对rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC进行中试放大（10 L和50 L）。结果表明，rONC在10 L和50 L最佳表达条件下的表达量分别为180.0 mg/L和195.0 mg/L；rHSA-M(0,1,2,3)-ONC在10 L最佳表达条件下的表达量分别为2.15、1.93、1.87、2.02 g/L，在50 L最佳表达条件下的表达量分别为2.26、2.13、1.94、2.12 g/L。
　　(4) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的分离纯化条件摸索及纯化体系放大：以rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC50L规模的发酵液为研究对象，进行分离纯化条件摸索。结果表明，经双水相偶联分子排阻层析，获得了纯度高于95%，收率高于90%的rONC；经双水相偶联 DEAE离子交换层析，获得了纯度均高于95%，收率均高于70%的rHSA-M(0,1,2,3)-ONC。
　　(5) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的活性测定：主要对rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的体外生物学活性(酶学活性、细胞毒性、稳定性)进行测定。首先利用酵母tRNA为反应底物和酶促反应动力学方法，测定了rONC和rHSA-M(1,2,3)-ONC的酶学活性，结果发现rONC和rHSA-M(1,2,3)-ONC对tRNA降解活性从高到低依次为rONC、rHSA-M3-ONC、rHSA-M2-ONC、rHSA-M1-ONC，而rHSA-M0-ONC在相同条件下未测得tRNA降解酶学活性；其次，利用SRB法测定rONC及rHSA-M(1,2,3)-ONC对18种细胞系（人实体瘤细胞、鼠实体瘤细胞、非实体瘤细胞以及正常细胞）活性的影响，结果表明，rONC和rHSA-M(1,2,3)-ONC抑制肿瘤细胞系的增殖，且对不同细胞系增殖的抑制作用有差异。其中，rONC对18种细胞系均有明显的抑制增殖作用，rHSA-M0-ONC对18种细胞系均无作用，rHSA-M(1,2)-ONC对18种细胞系中的部分细胞系（Hela、RH-35、B16、293T、WISH和NIH-3T3）具有抑制增殖作用，rHSA-M3-ONC能够对18种细胞中绝大多数(除DU145、HT-29、K562、HL-60、MEL和CHO外的12种)细胞株产生抑制增殖(等摩尔量条件下IC50约为rONC的3倍)，同时rONC及rHSA-M(1,2,3)-ONC对实体瘤细胞株的作用也要高于非实体瘤细胞株。稳定性试验表明：相同条件下(pH、温度和时间)，rONC及其融合蛋白的稳定性强弱依次为：rONC>rHSA-M(1,2)-ONC>rHSA-M3-ONC>rHSA-M0-ONC。
　　(6) rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC药代动力学测定：利用双抗夹心法测定rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC在大鼠体内的药代动力学，结果表明rONC的半衰期约为0.88±0.07 h，rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的半衰期依次为：13.16±0.31 h、14.24±0.24 h、14.86±0.12 h和14.58±0.35 h。
　　(7)结构-活性相关性分析：分析rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的一、二级结构，结合rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的酶学活性、细胞毒性、稳定性与半衰期，分析其结构-活性相关性，结果表明rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的酶活性和细胞毒性与连接肽长度相关，其中，rONC的酶活性和细胞毒性最强，rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的酶活性和细胞毒性与连接肽长度呈正相关；而稳定性和半衰期与连接肽长度无明确相关性。进一步分析rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC二级结构发现，随着rHSA-M(0,1,2,3)-ONC中连接肽长度的增加，其ONC部分的二级结构越近似rONC的二级结构，但rHSA-M(0,1,2,3)-ONC中 ONC部分有6个区域(3-10、19-23、35-45、57-69、85-89和96-102位氨基酸)发生结构变化，推测此变化可能与rHSA-M(0,1,2,3)-ONC活性降低有关。
　　结论：本文建立了rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的中试规模毕赤酵母高效表达及纯化生产工艺。其中，rONC在50 L规模下表达量达到195.0mg/L，较现有文献(150.0mg/L)提高了30%，建立了相应规模的纯化工艺，获得了纯度大于95%，收率高于90%且具有良好的生物学活性的rONC；rHSA-M(0,1,2,3)-ONC在50 L规模的表达量均达到2 g/L(等摩尔条件下rONC的2倍)，建立了相应规模的纯化工艺，获得了纯度大于95%，收率高于70%且具有良好生物学活性的融合蛋白。为阐明rONC的作用机制和设计更高活性的rONC及融合蛋白提供了理论支持，同时为rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的临床研究和产业化奠定了良好的基础。

目录

第一章 文献综述

1 重组蛋白的表达系统

2 重组蛋白的分离纯化方法

3 重组蛋白的应用

4 人血清白蛋白(HSA)的功能及应用

5 豹蛙抗瘤酶(ONC)的研究进展与应用前景

6 课题研究目的与意义

第二章 rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的工程菌构建、筛选及鉴定

引言

1 材料与方法

2 结果

3. 讨论

第三章 rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的小试条件优化

引言

1 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第四章 rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的中试试验

引言

1 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第五章 rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的分离纯化工艺优化

引言

1 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第六章 rONC及rHSA-M(0,1,2,3)-ONC的生物学活性测定及结构-活性相关性研究

引言

1 材料与方法

2 实验结果

3. 讨论

参考文献

总结与展望

总结

文章创新点

展望

附录 英文缩略语

致谢

攻读博士学位期间参加的科研项目和发表的论文

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