基于基因组消减杂交技术的石刁柏性别差异重复序列的克隆与定位

摘要

石刁柏(Asparagus officinalis)又名芦笋，是一种多年生雌雄异株草本植物，其单倍体基因组大小为1323 Mbp，具有2n=2X=20条染色体，其性染色体组成为同型XY型性染色体，在性染色体演化仍处于早期阶段，能更有利于进行植物性染色体起源和演化机制的研究。目前研究表明，植物XY性染色体起源于一对常染色体，其中的一条由于某种未知原因而累积了反转座子等重复序列而在体积上逐步扩展，进而从形态上逐渐演化为异型的XY性染色体。但是，重复序列的累积是否是性染色体体积扩展的普遍现象，是否参与了性染色体早期的演化过程等问题仍不清楚。因此，本文以石刁柏为材料，利用基因组消减杂交技术及生物信息学技术分离分析雌雄基因组差异重复序列，并采用中期染色体荧光原位杂交技术对获得的性别差异序列进行染色体定位，分析重复序列在性染色体起源和演化过程中可能的作用。为揭示石刁柏性染色体起源及演化的机制提供理论资料。主要研究结果如下:
　　1、以石刁柏雌雄基因组DNA为材料，利用通用引物M13对石刁柏6600个消减杂交克隆产物进行筛选，通过斑点杂交验证后获得98个雌雄差异序列。对测序成功的52条序列分析发现，所获得的序列长度分布在63bp-297bp。其中，33个属于非叶绿体基因组来源序列(命名为Ao1-Ao33)，包括3个反转录转座子，15个未命名序列，6个mRNA序列，9个其他序列。另外，19个序列属于叶绿体来源序列(命名为Ao34-Ao52)，Ao34-Ao50在核酸数据库中均有同源序列，相似度分布在84％-100％，Ao51相似度最低为37％。Ao52序列在数据库中未发现同源序列，其序列与石刁柏叶绿体基因组相似性为100％。为了进一步验证52个序列是否为性别差异的序列，利用基因组半定量技术对52个斑点杂交验证的差异序列进行分析。结果表明，其中9条差异序列为雌雄差异序列，包含5条为非叶绿体来源序列(分别为Ao6、Ao13、Ao15、Ao19、Ao29)。4条为叶绿体基因组来源序列(分别为Ao34、Ao36、Ao43、Ao51)，序列定位发现转移到核基因组的核叶绿体序列(nuclear integrants of plastid DNA，NUPTs)主要分布在叶绿体基因组的反向重复区(inverted repeat，IR)(包含IRa和IRb区)(分别为Ao34、Ao36、Ao43)。说明叶绿体反向重复区序列更容易向核基因组进行转移，这可能和该区域序列高拷贝数有关。
　　2、为了对所获得的性别差异序列进行染色体定位，将5条非叶绿体来源的差异序列从基因组中进行长片段扩增。其中，Ao6和Ao15两个序列成功获得长度分别为3048bp和528bp的长序列(分别命名为Ao6-L和Ao15-L)。中期染色体荧光原位杂交结果表明，Ao6-L序列在所有染色体着丝粒上有杂交信号，且在着丝粒上的信号强烈而明显。Ao15-L序列在所有染色体上均有杂交信号，且信号集中在着丝粒及其附近，距离着丝粒越近信号越强。由此可以得出差异重复序列在着丝粒位置富集最多。石刁柏染色体着丝粒含有大量重复序列，才使杂交信号在着丝粒及其附近堆积。
　　3、为了对所获得的叶绿体来源的序列进行染色体定位，首先根据石刁柏叶绿体基因组序列设计引物进行长序列扩增，其中，Ao52序列成功获得长度为2859bp(命名为Ao52-L)。中期染色体定位发现，Ao52-L序列在所有染色体上均有杂交信号，且信号从端粒到着丝粒呈现逐渐加强的特征，说明该NUPTs序列在着丝粒位置富集最多，这和水稻中期染色体NUPTs的分布特征相一致。其次，着丝粒位置本身存在较多重复序列，也进一步说明了从叶绿体转移到核基因组的序列也是组成着丝粒侧翼重复序列的重要成分之一。石刁柏叶绿体序列在核基因组中的插入，删除，以及重排是在新型核基因的产生的重要进化过程。

目录

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 前言

1．1 重复序列分类及作用

1．2 重复序列在植物性染色体演化中的作用研究概况

1．3 NUPTs的形成及其与植物性染色体演化的关系

1．4 石刁柏性染色体起源及演化研究进展

1．5 研究目的及其意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株和载体

2．1．3 引物

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 主要试剂及药品

2．1．6 常用溶液配方

2．2 方法

2．2．1 石刁柏DNA的提取及检测

2．2．2 石刁柏雌雄基因组消减杂交

2．2．3 雌雄性别差异序列的斑点杂交

2．2．4 性别差异序列生物信息学分析

2．2．5 性别差异序列半定量PCR及拷贝数分析

2．2．6 性别差异序列的中期染色体定位

3 结果与分析

3．1 石刁柏基因组DNA的提取

3．2 石刁柏雌雄株基因组DNA酶切及破碎

3．3 雌雄基因组DNA消减杂交产物克隆及分析

3．4 阳性克隆的斑点杂交

3．5 性别差异序列生物信息学分析

3．5．1 非叶绿体来源的序列的拷贝数估计及中期染色体定位

3．5．2 NUPTs拷贝数估计及中期染色体定位

4 讨论

4．1 重复序列与性染色体演化的关系

4．2 NUPTs与石刁柏性染色体演化的关系

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢

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