猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白假型病毒体系的建立

摘要

本试验利用RT-PCR方法分别克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)河南分离株Hn-1/06 GP5和GP6基因，并进行了遗传变异分析，结果表明该分离株的核苷酸序列和氨基酸序列与美洲型标准株VR2332的同源性分别为89.6％和89.5％；与国内江西分离株J-X0612的同源性分别为97.4％和96.0％。 将GP5、GP6基因克隆入真核表达载体：pcDN.A3.0，分别构建pcDNA-GP5单表达载体、pcDNA-GP5-GP6串联表达载体和pcDNA-GP5/6共表达载体，运用磷酸钙方法分别瞬时转染人胚肾细胞293T，48h后收集细胞，与抗PRRSV特异性血清及荧光素标记羊抗猪二抗反应，用流式细胞仪检测，GP5蛋白在2933T细胞表面获得表达，共表达重组质粒的GP5蛋白荧光标记细胞数达到48.5％；单一GP5重组质粒的GP5蛋白荧光标记细胞数达到33％；串联表达重组质粒的GP5蛋白表达标记细胞数很少，仅为7.3％。该试验结果说明PRRSV GP5蛋白和M蛋白异源二聚体的形成是对GP5蛋白的转运、定位是有影响的。 将构建好的pcDNA-GP5、pcDNA-GP5/6重组质粒分别与鼠自血病病毒(MuLV)病毒假型构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因，即gag和pol和pHI111(为MuLV的基因组及报告基因LacZ)瞬时共转染人胚肾细胞293T,48b后收获PRRS病毒假型粒子，超速离心浓缩病毒粒子，SDS-PAGE电泳，与抗GP5特异性血清及辣根过氧化物酶标记二抗反应，Western blot证实GP5蛋白在病毒假型颗粒表面表达，GP5蛋白整合到病毒假型粒子表面。将病毒假型粒子感染Marc-145和猪肺巨噬细胞(PAM)等不同的靶细胞,48h后检测报告基因，证实所构建的病毒假型粒子有感染性，确定GP5基因编码蛋白与病毒感染有关的糖蛋白抗原；同时发现由M蛋白介导GP5蛋白假型病毒颗粒的感染低度比单一GP5蛋白假型病毒颗粒感染低度高。 本研究通过Western blot试验发现GP5蛋白在形成的病毒假型颗粒表面获得表达。通过感染性试验发现，其形成的假型病毒具有感染性，能够感染其宿主细胞，说明在细胞表面有PRRSV GP5蛋白的受体。经过Western blot和感染性试验证明我们已经成功构建了PRRSV的MuIV假型病毒体系，为研究PRRSV侵入细胞的机理提供了一个手段，为研究其在受体特性和组织嗜性上的变异提供了一个技术平台，也为研究PRRSV疫苗及治疗性药物具有重要的指导意义，为控制PRRS打下理论基础。

目录

论文说明：本论文常用缩略词

声明

致谢

摘要

文献综述

第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

第二章 病毒假型技术的原理及其应用

试验一猪繁殖和呼吸综合征病毒河南分离株GP5基因的克隆及在293T细胞中表达

1材料与方法

2结果

3讨论

试验二猪繁殖和呼吸综合征病毒河南分离株GP5重组载体构建及在293T细胞中表达

1材料与方法

2结果

3讨论

试验三整合猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的重组鼠白血病病毒特性

1材料与方法

2结果

3讨论

试验四猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白介导的E蛋白假型鼠白血病病毒的构建

1材料与方法

2结果

3讨论

全文结论

参考文献：

发表论文

附录:猪繁殖与呼吸综合病毒RT-PCR检测技术