猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)体外繁殖能力差,病毒感染细胞后增殖滴度低,且不产生细胞病变,病毒感染动物临床表现不一,组织中病毒载量差异大。为了建立定量检测PCV2及增殖滴度的方法,本研究采用SYBR Green I随机结合法,利用常规PCR扩增出PCV2 ORF2保守区域276bp片段,将其克隆到pMD—18载体,构建重组质粒p-18T-276,并用作标准质粒模板优化反应条件,建立一种PCV2 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果表明,标准品模板在5.60×101～2.74×109copies/μL时与Ct值呈良好的线性关系,相关系数为-1.00,斜率为-3.345。所建立的方法与猪圆环病毒1型、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖障碍与呼吸系统综合征病毒、猪细小病毒和猪瘟病毒均无交叉反应。 应用建立的PCV2 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法对PCV2感染细胞后的复制情况进行了研究,结果显示,在感染细胞96h时,PCV2复制达到最高点。此外,利用建立的方法对本室保存的11个分离株在PK15细胞上繁殖特性进行了研究,筛选到了4株高滴度毒株(河南株5、太平株、瑞丰株、宜阳株),丰富了圆环病毒疫苗株的研究资源。选择8株毒株,以大致相等的拷贝数分别攻毒6周龄SPF昆明鼠,14天时剖杀并定量检测PCV2在不同器官中的组织载量,发现河南株5和瑞丰株、太平株在靶组织中具有更高的增殖滴度。 为了测定板蓝根多糖、黄芪多糖体外抗PCV2的效果,本试验按不同的加药方式设计了2组试验,第1组先接种病毒后加药物,以观察药物能否对细胞内的病毒起作用,抑制其生物合成及成熟释放；第2组先加药物后接种病毒,以观察药物能否阻断病毒的吸附和进入。结果表明,板蓝根多糖对PCV2具有抑制和阻断作用,其最小抑制浓度和最小阻断浓度分别为9.375μg/mL和2.344μg/mL；黄芪多糖对PCV2亦有抑制作用和阻断作用,其最小抑制浓度和最小阻断浓度分别为18.750μg/mL和2.344μg/mL。
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