人源志贺菌对SPF雏鸡、鸡肠上皮原代细胞的侵袭性及肠组织CD44分子的时空性表达研究

摘要

志贺菌为革兰阴性兼性细胞内致病菌,临床上可以引起人细菌性痢疾。许兰菊、王川庆等于2004年首次报道了鸡志贺菌病例,主要以雏鸡脓血痢为特征。对我国部分地区有不同程度腹泻病史的鸡群进行志贺菌感染血清流行病学调查发现,鸡志贺菌血清抗体阳性率达28.3％-33.7％。病原学研究发现该致病菌在生物学及血清学特性等方面与人源志贺菌完全相同。通过对细菌的管家基因及基因组分析结果可知,鸡志贺菌与人源菌同源性极高,是与人志贺菌密切相关的或是他们的亚种,从整个基因水平上看,鸡志贺菌可能起源或来源于人志贺菌。为此,本文针对人志贺菌对鸡的致病性及致病机制开展了初步研究。
　　 作者通过生化试验、血清学试验、豚鼠角膜试验、小鼠攻毒试验、PCR方法对7株病人临床腹泻样品分离菌株进行了鉴定。在此基础上,对分离株毒力基因ipaH、ipaB、ipaC、setlA、sen进行扩增,研究志贺菌质粒在传代中的稳定性。结果显示ZD01、ZD02菌株为福氏志贺菌,豚鼠角膜试验呈阳性,可以致死小鼠,且均可检测到毒力基因ipaH、ipaB、ipaC、set1A、sen。毒力基因传代结果显示ZD01、ZD02志贺菌分别在连续传代至22代次、26代次后出现毒力基因缺失。人源ZD01、ZD02志贺菌菌株的获得为后续试验提供了基础材料。
　　 为了解人源志贺菌对雏鸡的致病性,分别选取3日龄的SPF鸡作为志贺菌攻毒试验的体内感染模型；选取鸡胚肠组织原代细胞作为体外感染模型。雏鸡体内攻毒试验表明志贺菌的半数致死量为腹腔注射0.85×106个细菌,口服感染不引起雏鸡死亡,腹腔注射6 h后在心、肝、脾、肺组织中均可分离回收到志贺菌,18 h在肺脏中达到最高峰。体外感染试验电镜观察在肠组织原代上皮细胞胞质中可见志贺菌的存在。以上试验说明人源志贺菌腹腔注射可以引起雏鸡发病,并且在体外可侵袭鸡胚肠组织原代上皮细胞。
　　 为进一步了解人源志贺菌对鸡胚肠组织原代上皮细胞的侵袋机制,选取CD44分子作为研究对象。首先鉴定CD44分子在雏鸡肠组织原代上皮细胞是否表达,为此设计特异性引物,建立反转录PCR方法进行CD44 mRNA的扩增；为进一步了解CD44的时空表达特性,建立了定量检测鸡CD44基因和GAPDH基因mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT—PCR方法,并采用该方法对1-28日龄商品鸡鸡肠组织原代上皮细胞中CD44 mRNA表达水平进行了检测。结果显示:鸡肠组织原代上皮细胞中可以扩增到CD44 mRNA,所建立的荧光定量方法的扩增效率分别为95％和101％;线性范围均在108-104 copies/μL；最低检测限量分别为45个和77个拷贝；该方法敏感性高、稳定性和重复性好；雏鸡不同肠组织原代上皮细胞随着日龄的增加,表达有所差异,在1到10日龄之间盲肠、直肠组织原代上皮细胞CD44的表达量较高。本研究初步证明了人源志贺菌可以感染鸡肠组织原代上皮细胞,雏鸡肠组织原代上皮细胞中存在CD44的表达,其表达量可能与志贺菌的感染日龄有关。本文为进一步研究志贺菌的作用机制提供了借鉴。