隐孢子虫禽基因型V生物学特性和分子遗传学特征研究

摘要

隐孢子虫是家养、笼养和野生禽类最常见的寄生虫之一。目前，公认的寄生于禽类的隐孢子虫有3个有效种，分别为贝氏隐孢子虫(Cryptosporidiumbaileyi)，火鸡隐孢子虫(C。meleagridis)和鸡隐孢子虫(C.galli)。关于隐孢子虫禽基因型Ⅴ(CryptosporidiumaviangenotypeⅤ)只有两篇报道，报道仅限于流行病学和分子生物学特征研究。
　　 为研究隐孢子虫禽基因型V的生物学特性，即卵囊形态、感染寄生宿主、感染寄生部位。本试验从郑州宠物市场采集鸡尾鹦鹉的粪便，使用饱和蔗糖溶液漂浮法进行检测，阳性样品保存在2.5％的重铬酸钾溶液中。隐孢子虫卵囊纯化后基于18SrRNA基因位点进行巢式PCR扩增，确定其为禽基因型Ⅴ，用于试验。30只3日龄雏鸡、15只3日龄雏鸭、6只40日龄罗曼公鸡、8只30日龄BALB/c小鼠、8只30日龄蒙古沙鼠、30只10日龄鹌鹑、6只虎皮鹦鹉，每只动物经口灌喂1×106个卵囊，另外同等数量的动物灌喂等体积蒸馏水作为对照组。采用饱和蔗糖溶液漂浮法和血细胞计数法检查感染后排卵囊规律，同时剖杀动物检查寄生部位。经调查隐孢子虫禽基因型Ⅴ只自然感染鸡尾鹦鹉；动物交叉感染试验中隐孢子虫禽基因型Ⅴ的卵囊成功感染3日龄雏鸡，潜隐期为8d，显露期为20d；感染3日龄雏鸭，潜隐期为9d，显露期为19d；感染40日龄罗曼公鸡，潜隐期为8d，显露期为9d；隐孢子虫禽基因型Ⅴ不感染10日龄鹌鹑、30日龄BALB/c小鼠、30日龄蒙古沙鼠和30日龄虎皮鹦鹉。石蜡组织切片和扫描电子显微镜观察，隐孢子虫禽基因型Ⅴ只寄生于感染动物法氏囊黏膜上皮细胞中，且在法氏囊黏膜皱襞边缘寄生较多。经微分干涉显微镜观察并测量卵囊大小，隐孢子虫禽基因型Ⅴ的卵囊大小为(4.58-5.89)μm×(3.98-4.83)μm，平均为5.42μm×4.46μm，卵囊指数为1.22。
　　 为研究隐孢子虫禽基因型Ⅴ的分子遗传学特征。本试验选取18SrRNA、actin、HSP70和COWP基因位点进行巢式PCR扩增，对扩增产物进行测序分析；对18SrRNA的第二套扩增产物进行RFLP试验。隐孢子虫禽基因型Ⅴ的18SrRNA、actin、HSP70基因位点扩增目的片段长度分别为830bp、1066bp、1950bp；COWP基因位点未扩增出目的条带；RFLP试验中禽基因型V的SspⅠ酶切片段大小均为497bp，253bp；VspⅠ酶切片段大小为621bp，115bp，104bp；18SrRNA基因位点种系发育结果显示隐孢子虫禽基因型Ⅴ与隐孢子虫禽基因型Ⅱ在同一进化枝中，同源性为99.4％，与C.baileyi组成一个大分支，同源性为96.4％；actin基因位点种系发育结果显示隐孢子虫禽基因型Ⅴ与隐孢子虫禽基因型Ⅱ在同一进化枝中，同源性为98.2％，与C.baileyi组成一个大分支，同源性为89.8％；HSP70基因位点的种系进化分析显示隐孢子虫禽基因型Ⅴ与隐孢子虫禽基因型Ⅱ在同一进化枝中，同源性为95.7％，与C.baileyi的分支较远，同源性仅为88.6％。以上结果均显示隐孢子虫禽基因型Ⅴ与其他隐孢子虫种/基因型在生物学和分子遗传学上有差异，具有成为一个独立的隐孢子虫种的可能性。
　　 综合本试验的研究以及隐孢子虫新种命名规则，认为隐孢子虫禽基因型Ⅴ是一个新的隐孢子虫种，并命名为鸡尾鹦鹉隐孢子虫(C.cockatieli)。