激流式生物反应器大规模培养IBDV及制备高效灭活疫苗的研究

摘要

鸡传染性法氏囊病(InfectiousBursalDiseaseVirus，IBD)是由IBD病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性、免疫抑制性传染病。该病自20世纪80年代传入我国，至今仍是危害最为严重的禽病之一。目前，该病主要通过疫苗接种来防控。除给雏鸡使用活疫苗免疫外，通常还给种鸡注射灭活疫苗使雏鸡获得高的母源抗体，以保护其在生命早期不感染传染性法氏囊病病。国内鸡传染性法氏囊病灭活疫苗通常是采用鸡胚成纤维细胞培养病毒制备而成，免疫效果差，在生产中应用效果不好。目前，国内各大种鸡场大多采用进口灭活疫苗。近年来，生物反应器大规模培养技术逐渐用于兽用生物制品。但目前对IBDV的研究不多，国内也有利用Vero细胞在生物反应器上增殖IBDV的报道，但是，没能得到应用。根据研究鸡传染性法氏囊病高效灭活疫苗的需要，本研究采用鸡胚源DF-1细胞系，通过生物反应器中微载体悬浮培养，获得比传统培养方法提高100倍的高效价病毒抗原，并用其成功研制了一种优质、高效的法氏囊灭活疫苗，以满足市场的需要。研究结果如下：
　　 1根据高效培养IBDV对于病毒滴度检测的需要，针对鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP4基因的保守序列设计并合成了一对引物，以所构建的重组质粒作为阳性标准品，成功建立了检测IBDV核酸载量的SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR(QRT-PCR)方法。应用该方法和经典TCID50方法初步对IBDV在方瓶中增殖动态的测定结果表明，两种方法测定的方瓶DF-1细胞中IBDV的增殖曲线具有一定的平行关系，但QRT-PCR方法(4h)比TCID50方法(3-4d)更快速和敏感。
　　 2应用所建立的QRT-PCR方法首次对微载体转管微型反应器和AP10生物反应器培养的DF-1细胞中IBDV的增殖特性进行了较为系统的研究，并与经典的TCID50测定法进行了比较。结果表明：①转管(内置0.6g纸片载体)中接种3×107个DF-1细胞，培养144h细胞可增至最大值2.4～2.5×108个，为最佳接毒时间；最佳接毒剂量为0.79MOI，最佳收毒时间为接毒后的28h；上清和全悬液毒价呈平行关系，但后者更高，可达9.5(-1gTCID50/mL)以上(为转瓶毒价的10倍)。②转管中细胞数增长与糖耗间呈明显平行关系，在细胞生长期内(144h)平均每个细胞耗糖量为6.5×10-10g/24h，可根据糖耗量推测细胞生长状态和数量；接毒后糖耗速率的高峰要先于病毒滴度的高峰，在糖耗高峰出现后下降至趋于零的瞬间收获，可获得较高毒价的病毒液。③在转管培养毒价高峰时收获1/3毒液后9h，收获1/2毒液后18h可再次获得最高毒价的毒液；④反应器中接毒剂量为1.05MOI时，接毒后24h最高毒价达到9.5(-1gTCID50/mL)；1/2换液后8h最高毒价只达到9.25(-1gTCID50/mL)。⑤反应器中糖耗高峰比毒价高峰早，在耗糖量下降为0的左右病毒毒价达到高峰，但是毒价高峰与接毒时的细胞数和接毒剂量有关。⑥荧光定量测定的高密度培养条件下IBDV毒价的上升和下降趋势及高峰的时间与FCID50测定结果基本一致，但荧光定量方法更快速和敏感。
　　 3用IBDV细胞毒HQ株在鸡胚源DF-1细胞系上连续传10代，并对10代内的细胞毒液分别进行了病毒含量测定及免疫原性、特异性、保存期和纯净性的鉴定，证明在10代内HQ株细胞毒的上述特性基本一致，从而建立了IBDVHQ株的生产种子批。将IBDVHQ株反应器DF-1细胞培养液(109.5TCID50/mL)、转瓶DF-1(108.5TCID50/mL，3倍浓缩)及CEF细胞培养液(107.5TCID50/mL，5倍浓缩)按试行规程制备灭活疫苗，并进行各项检验。结果表明，其半成品及成品检验(物理性状检验、无菌检验、安全试验)均符合规程要求。三种疫苗免疫原性检验结果显示，DF-1细胞反应器疫苗中和抗体明显高于转瓶苗，攻毒保护免疫组两种DF-1疫苗都为100％保护，对照组保护率为0，CEF苗中和抗和攻毒保护都较DF-1苗低。
　　 本研究通过利用转管载体微型反应器进行DF-1细胞高密度培养，在自动控制的生物反应器中进行IBDV最佳培养条件和收毒方式的探索，从而为工厂化大规模培养IBDV及制备高效灭活疫苗提供理论依据和实践经验，因而具有很大的实用性。