天牛科线粒体基因特征与系统发育初步研究

摘要

长期以来，天牛的分类学研究主要以外部形态为主，然而由于形态特征的局限性，不同学者根据不同的形态特征所得到的结果往往存在较大的差异，导致某些天牛类群的归属及天牛科内部的亲缘关系一直存在争议。线粒体基因包含丰富的遗传信息，常用于昆虫的分类鉴定中，其特征分析结果还可以进一步用于探讨昆虫的系统发育关系。然而目前GeneBank数据库中已登录的天牛科线粒体序列比较有限，而且关于天牛科高级阶元的分子系统学研究至今鲜有报道。因此本研究以线粒体COⅠ、COⅡ和16SrRNA为分子标记，研究了66种天牛的线粒体序列特征及各类群间的亲缘关系，主要结果如下:
　　(1)通过PCR扩增，得到了66天牛的线粒体COⅠ、COⅡ和16SrRNA基因全长或部分序列。在66种天牛中，31种属于沟胫天牛亚科，24种属于天牛亚科，5种属于锯天牛亚科，3种属于幽天牛亚科，2种属于花天牛亚科，1种属于瘦天牛科。COⅠ、COⅡ和16SrRNA基因平均长度分别为1547.19bp、581.64bp和505.89bp，保守位点比例分别为46.71％，34.36％和41.98％，A+T含量分别为66.61％、69.97％和72.66％，具有一定的碱基偏向性。COⅠ和COⅡ基因密码子第3位点A+T偏向性最高，进化速率最快，密码子第2位点进化速率最慢。COⅠ基因密码子含量最高的是ATT(I)7.85％，然后是TTA(L)6.84、GGA(G)5.97、TTT(F)5.58，TGC的含量为0。COⅡ基因密码子含量最高的是ATT(I)10.26％，然后是是TTA(L)7.06、TTT(F)4.95、GAT(D)3.81，半胱氨酸(Cystine，C)含量为0。COⅠ和COⅡ基因起始密码子多是ATT(I)，COⅠ终止密码子主要是TAA，少数以TA结尾，不含TAG。
　　(2)利用MEGA5.05软件统计了COⅠ、COⅡ和16SrRNA基因转换和颠换发生次数，发现转换发生次数均小于颠换，R值（转换/颠换）分别为0.93、0.73和0.52。转换主要发生在T-C之间，颠换主要发生在T-A之间，各序列存在不同程度的饱和趋势，尤其是COⅠ、COⅡ密码子第三位点。COⅠ、COⅡ、16SrRNA以及联合序列的转换、颠换值均与P距离表现出很好的线性关系，说明碱基的突变未达到饱和，可以用于构建分子系统进化树。
　　(3)利用MEGA5.05软件统计了COⅠ、COⅡ、16SrRNA和联合序列的未校正p-distance，4种距离表所表现的信息大致相同。以联合序列为分析对象时，花天牛亚科和幽天牛亚科与叶甲科具有最小的遗传距离，瘦天牛科与天牛科各亚科均有着较高的遗传距离（0.249～0.268），且比较稳定，说明瘦天牛科级地位的合理性。狭胸天牛与三种锯天牛亚科成员平均遗传距离为0.223，达到亚科级差异水平，应将狭胸天牛独立为亚科。天牛科内，花天牛亚科和幽天牛亚科间遗传距离最近，天牛亚科和花天牛亚科、幽天牛亚科距离较近，沟胫天牛亚科内平均遗传距离小于天牛亚科内平均遗传距离。
　　(4)利用最大似然法(maximum likelihood，ML)和贝叶斯法(bayesian inference，BI)构建了天牛科分子进化树，COⅠ、COⅡ、16SrRNA和联合序列的分析结果各不相同，但由联合序列所构建的ML树和BI树具有最高的置信度，且联合序列ML树和BI树间差异最小，与形态学分类拟合度最高。在联合序列ML和BI树中，当以叶甲科为外群时，幽天牛亚科和花天牛亚科从进化树基部依次分化，沟胫天牛亚科和天牛亚科为单系群。瘦天牛科优先与锯天牛亚科聚集在一起，但是并没有得到较高置信度支持，狭胸天牛并没有优先与锯天牛亚科结合，因此应从锯天牛亚科中独立出来。天牛亚科中，绿天牛族和双条天牛族互为姊妹群，天牛族和折天牛族互为姊妹群，虎天牛族为单系群。沟胫天牛亚科中，长角天牛族、伪昏天牛、刺胸毡天牛位于系统树的基部，瓜天牛族和坡天牛族互为姊妹群，多节天牛族和骇天牛族互为姊妹群，沟胫天牛族和白条天牛族、粉天牛族具有较近的亲缘关系，楔天牛族为单系群，并处于进化树的顶端。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 天牛科昆虫概述

1．1．1 天牛科形态特征与经济意义

1．1．2 天牛科分类系统

1．1．2 天牛科起源及系统演化关系

1．2 分子系统学研究进展

1．2．1 分子系统学理论基础

1．2．2 线粒体DNA组成及结构特征

1．2．3 分子系统学研究方法

2 引言

3 材料与方法

3．1 研究材料

3．1．1 标本采集与保存

3．1．2 主要试剂

3．1．3 仪器设备

3．2 研究方法

3．2．1 基因组DNA的提取、检测与保存

3．2．2 PCR扩增、检测与测序

3．2．3 序列处理与分析

3．2．4 分子系统树构建

4 结果与分析

4．1 基因组DNA提取

4．2 PCR扩增与序列验证

4．3 序列分析

4．3．1 序列长度及碱基组成

4．3．2 碱基置换分析

4．3．3 密码子使用偏向性

4．3．4 置换饱和度分析

4．4 遗传距离分析

4．4．1 COⅠ遗传距离

4．4．2 COⅡ遗传距离

4．4．3 16SrRNA遗传距离

4．4．4 联合序列遗传距离

4．5 分子进化树

4．5．1 COⅠ进化树

4．5．2 COⅡ进化树

4．5．3 16SrRNA进化树

4．5．4 联合序列进化树

5 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

参考文献