番茄突变体遗传分析和抗晚病机理的初步研究

摘要

番茄晚疫病（Phytophthora infestans）是危害番茄的一个重要病害，在设施栽培条件下发生尤其严重。由于晚疫病菌存在进化潜力大，变异频繁等特点，从番茄不同野生种中鉴定出的抗晚疫病的R基因(Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4和Ph-5)均已经被克服，失去抗性。因此要培育持久抗病的番茄品种，就需加深对番茄与晚疫病互作调控机制的了解。
　　马铃薯中克隆的R3a基因和晚疫病菌中克隆的Avr3a基因是第一个被克隆的R-Avr基因对，符合“基因对基因”假说。马铃薯是同源四倍体植物，长期营养繁殖基因组高度复杂，不适宜作为研究的实验材料，因此本研究利用在模式作物番茄中构建的一个含有抗晚疫病基因R3a和地塞米松(DEX)诱导表达相应无毒基因Avr3a的高效研究系统:MM-R3a-Avr3a，通过构建EMS突变体库、施用诱导剂DEX筛选存活突变体，通过对一系列阻断R3a-Avr3a互作的突变体的分子鉴定和遗传分析，为参与抗病信号途径中的关键基因克隆提供研究基础。本研究主要结论如下:
　　1.转基因番茄MM-R3a-Avr3a经EMS诱变处理后，构建突变体库，经过DEX处理，筛选到1057（Mutant1）和2308（Mutant2）两个HR反应阻断的突变体家系;RT-PCR结果显示R3a和Avr3a基因正常表达，可知关键基因的突变导致R3a-Avr3a互作信号识别途径被阻断;晚疫病菌接种结果显示突变体番茄对晚疫病菌的抗性丧失。
　　2.将两个纯和HR阻断突变体家系分别与番茄Moneymaker和转基因番茄MM-R3a-Avr3a杂交。遗传分析结果显示，1057和2308两个HR反应阻断的突变体家系F2代HR反应和无HR反应分离比例符合3∶1，确定1057和2308家系为单基因隐形突变。
　　3.对1057和2308家系进行活性氧途径分析可知，DEX处理突变体后有O2-的产生和H2O2累积，但却并未伴随HR反应的发生，说明在突变体中早期的O2-的产生和H2O2累积的途径并未被阻断。qRT-PCR结果和抗氧化酶活性结果显示，DEX处理后突变体中(POD、CAT、APX)与对照间均表现出差异，突变体中的抗氧化基因（SOD、CAT、 PPO）未表现上调表达，证实了突变基因与抗氧化途径关系密切。
　　4.通过对乙烯释放量的分析结果显示，突变体番茄中乙烯释放量均受到了抑制。对ET、JA和SA抗病途径的一些关键基因分析可知，转基因番茄MM-R3a-Avr3a与Moneymaker相比，EIN2、COI1、JAR1、EDS1、NIM1、PR1基因在DEX处理后，表达量均有不同程度的增加，说明这些基因参与了R3a-Avr3a基因互作信号传导，而突变体中除JAR1和NIM1基因过量表达外，其余基因表达量均受到抑制，由此可知突变体中的突变基因位于EIN2、COI1、EDS1、NIM1、PR1等基因的上游，是R3a-Avr3a互作途径中较早参与信号传导的基因。

目录

声明

致谢

英文缩略表

摘要

1 文献综述

1．1 番茄晚疫病的危害

1．2 番茄晚疫病的防治措施

1．3 番茄晚疫病抗性分子生物学研究

1．3．1 番茄对晚疫病抗性遗传

1．3．2 番茄对晚疫病基因定位

1．4 番茄晚疫病抗性生理机制研究

1．4．1 细胞学和组织学研究

1．4．2 植物病程相关蛋白

1．4．3 植保素

1．4．4 植物防御酶系统

1．4．5 碳水化合物

1．4．6 诱导抗病性

1．5 植物抗病机制研究

1．5．1 基因对基因假说

1．5．2 植病互作模式

1．5．3 过敏反应

1．5．4 植物抗病信号传导

2 引言

3 材料与方法

3．1 植株材料和生长环境

3．1．1 植物材料

3．1．2 生长条件

3．2 试剂和设备

3．3 试验方法

3．3．1 突变体植株的自交和杂交

3．3．2 DEX鉴定

3．3．3 R3a基因和Avr3a基因PCR鉴定

3．3．4 细胞死亡染色

3．3．5 番茄叶片离体晚疫病菌接种鉴定

3．3．6 H2O2组织染色

3．3．7 番茄中ET含量的测定

3．3．8 抗氧化酶测定

3．3．9 引物的设计和筛选

3．3．10 RT-PCR

3．3．11 实时荧光定量PCR

3．3．12 数据统计分析

4 结果分析

4．1 诱导剂DEX处理后表型分析

4．1．1 诱导剂DEX处理后转基因番茄MM-R3a-Avr3a表型分析

4．1．2 诱导剂DEX处理后突变体表型分析

4．1．3 R3a和Avr3a基因PCR分析

4．1．4 马铃薯晚疫病病原菌离体接种鉴定

4．2 纯合突变体筛选和遗传分析

4．2．1 纯合突变体筛选

4．2．2 突变体的杂交和遗传分析

4．3 晚疫病过敏反应阻断突变体活性氧途径分析

4．3．1 DEX处理后突变体中O2-和H2O2的变化

4．3．2 DEX处理后对突变体中抗氧化酶基因SOD、CAT、PPO相对表达量的影响

4．3．3 DEX处理后对突变体中抗氧化酶POD、CAT、APX活性的影响

4．4 突变体中ET、JA、SA信号途径关键基因的表达变化

4．4．1 RNA纯度和含量检测

4．4．2 突变体中乙烯(ET)含量及抗病途径关键基因表达的变化

4．4．3 突变体中茉莉酸(JA)抗病途径关键基因表达的变化

4．4．4 突变体中水杨酸(SA)抗病途径关键基因表达的变化

5 结论与讨论

5．1 结论

5．1．1 DEX处理后突变体表型分析

5．1．2 纯和突变体筛选和遗传分析

5．1．3 晚疫病过敏反应阻断突变体活性氧代谢

5．1．4 晚疫病过敏反应关键基因的筛选

5．2 讨论

5．2．1 过敏反应机制的抗病应用研究

5．2．2 突变体遗传分析

5．2．3 晚疫病过敏反应阻断突变体活性氧代谢

5．2．4 晚疫病互作信号途径传导

参考文献