兔卵巢数字基因表达谱的构建及繁殖相关基因的筛选

摘要

本试验以我国著名地方品种兔—哈尔滨白兔(Harbin white rabbit)及世界著名中型肉用品种兔—加利福尼亚兔(Californian Rabbit)为研究对象，构建2个不同发育时期的哈尔滨白兔卵巢数字基因表达谱(Distal gene expression，DGE)及1个经产加利福尼亚兔卵巢DGE。运用RNA高通量测序技术(RNA-seq)对构建的文库进行测序，并对结果进行生物信息学分析。运用荧光实时定量RT-PCR技术对随机选取的6个差异表达基因进行了表达验证。
　　上述研究获得以下主要结果:
　　1、构建低产加利福尼亚兔(poor)，高产哈尔滨白兔(prolific)及未达到性成熟哈尔滨白兔(neanic)卵巢DGE测序文库，经测序分析分别得到7，159，832，7，637，178和7，596，342条原始Tag。去掉杂质标签后得到clean tag分别为7，079，460，7，469，924和7，388，202条，占总tag数的98.88％，97.81％和97.26％。之后，以兔转录组数据库为DGE分析的参照数据库，进行了基因注释和标准化分析。
　　2、对比neanic和poor DGE数据，以poor为对照，在neanic中共筛选到1610个差异表达基因，其中上调表达的有1284个，下调表达的有326个。在这些差异表达的基因中，差异表达倍数达10倍以上的共有5个，其中上调表达的有4个，下调表达的有1个。上调表达的基因差异倍数最高达12倍，下调表达的基因差异倍数最高达11.95倍，但以差异倍数2-4倍的居多。
　　3、对比neanic和prolific DGE数据，以prolific为对照，在neanic中共筛选到882个差异表达基因，其中上调表达的有727个，下调表达的有158个。在这些差异表达的基因中，差异表达倍数达5倍以上的24个，其中上调表达的有16个，下调表达的有8个。上调表达的基因差异倍数最高达11.88倍，下调表达的基因差异倍数最高达9.442倍，但以差异倍数1-3倍的居多。
　　4、对比prolific和poor DGE数据，以prolific为对照，在poor中共筛选到321个差异表达基因，其中上调表达的有180个，下调表达的有141个。在这些差异表达的基因中，差异表达倍数达10倍以上的共有5个，其中上调的有4个，下调的有1个，上调表达的基因差异倍数最高达12.04倍，下调表达的基因差异倍数最高达12.25倍，但以差异倍数2-3倍的居多。
　　5、对差异表达基因进行GO功能注释，在poor/neanic对比组中，共筛选到69个显著富集的Go Terms。在这些差异基因显著富集的Go Terms中，有11个与细胞组成有关，20个与分子功能相关，38个与生物学过程相关;在prolific/neanic对比组中共筛选到筛选67个显著富集的Go Terms，18个与细胞组成有关，17个与分子功能相关，32个与生物学过程相关;在prolific/poor对比组中，共筛选到18个差异基因显著富集的Go Terms，其中2个与细胞组成有关，1个与分子功能相关，15个与生物学过程相关
　　6、Pathway通路分析表明，在prolific/neanic对比组中差异基因显著富集的pathway通路共25个;在poor/prolific对比组中差异基因显著富集的pathway通路共27个。
　　7、Pathway富集分析显示，在对比组prolific/neanic中，差异表达基因显富集在与细胞生长分裂相关的细胞周期、DNA复制、孕激素介导的卵母细胞成熟和卵母细胞减数分裂信号通路中的个数分别为21、6、13、13个;差异基因富集在与信号传导相关的NOD-样受体信号通路、刺猬信号通路、胞质DNA传感通路、P53信号通路和TOLL-样受体信号通路中的个数分别为12、8、7、10个;差异基因富集于类固醇的生物合成、类固醇激素的生物合成和维生素B6代谢通路中的个数分别为4、7、2个。
　　8、Pathway富集分析显示，在对比组poor/prolific中，差异表达基因显著富集在与代谢相关的代谢途径、果糖甘露糖代谢、谷胱甘肽代谢、丙酮酸代谢、脂肪酸合成代谢、半乳糖代谢、硫代谢、细胞色素P450所介导的药物代谢及细胞色素P450所介导的外源物质代谢通路中的个数分别为40、6、5、4、2、3、2、5、7个;差异基因富集在类固醇生物合成、类固醇激素生物合成和肾素-血管紧张素系统中的个数分别为4、6、3个。此外，差异基因在ABC转运蛋白、PPAR信号通路和脂肪细胞因子信号通路中的个数分别为4、7、5个。
　　9、通过对poor/prolific对比组中所得的321个差异表达基因的分析，最终筛选出5个与兔繁殖力紧密相关的基因，分别为FSHR，BMP6，BMP15，INHBB和HSD17B1。
　　10、从所得差异基因中随机抽取6个差异表达基因，并利用RT-PCR检测组间基因相对表达量，所得结果与DGE试验结果在表达趋势上一致，从而证明了DGE在差异基因表达研究上的准确性和可靠性。

目录

声明

致谢

摘要

论文说明

1 文献综述

1．1 免的繁殖力及繁殖相关介绍

1．1．1 哈尔滨白兔简介

1．1．2 加利福尼亚兔简介

1．2 免卵巢的结构

1．2．1 生殖上皮

1．2．2 卵巢基质

1．2．3 卵巢皮质、髓质及门细胞

1．3 卵巢功能

1．3．1 卵巢中卵泡的发生

1．3．2 卵巢所分泌的激素及其对繁殖力的影响

1．4 数字基因表达谱测序简介

1．4．1 测序技术发展历程

1．4．2 数字基因表达谱的发展过程及技术原理

2 哈尔滨白兔及加利福尼亚免卯巢DGE分析

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 试验动物及样品采集

2．2．2 试验仪器

2．2．3 试验试剂

2．2．4 免卵巢总RNA的提取

2．2．5 兔卵巢总RNA质量检测

2．2．6 免卵巢cDNA文库的构建、文库质量检测及solexa测序

2．2．7 测序数据的获得

2．2．8 差异表达基因的筛选方法

2．2．9 测序结果的生物信息学分析

2．3 RT-PCR对DGE结果的检测

2．3．1 总RNA的提取及质量的检测

2．3．2 RT-PCR检测

3 试验结果

3．1 总RNA质量检测结果

3．1．1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

3．1．2Agilent 2100检测结果

3．2 免卵巢DGE结果与分析

3．2．1 免卵巢组织基因表达谱高通量测序数据

3．2．2 测序饱和度分析

3．2．3 Tags比对结果

3．2．4 差异表达基因的筛选

3．2．6 GO功能显著性富集分析

3．2．7 Pathway显著富集分析

3．2．8 繁殖及生长发育相关基因的筛选

3．2．9 RT-PCR实验结果

4 讨论

4．1 哈尔滨白兔及加利福尼亚免卯巢DGE数据分析

4．2 Go富集分析

4．3 Pathway富集分析

5 结论

参考文献