浙江省枫香天然群体的遗传多样性分析

摘要

枫香（Liquidambar formosana Hance.）系金缕梅科（Hamamelidaceae）枫香属落叶乔木，分布于秦岭淮河以南地区，跨北热带和南、中、北亚热带等4个气候带，是我国重要的乡土阔叶速生树种，集观赏、药用和材用等多种价值于一身。近年来对枫香的研究主要集中在无性繁殖技术、人工林和混交林技术、叶片的叶色分析、种子生物学特性、枫香树林的生理生化研究及园林应用等方面，而对其分子水平的遗传多样性研究较少，本研究将SRAP这种新的DNA分子标记运用到枫香的遗传多样性研究上，以期为枫香不同居群的遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图谱构建和分子育种等领域研究提供参考
　　本试验以浙江省7个枫香群体（杭州市淳安县、杭州市桐庐县、丽水市莲都区、温州市文成县、衢州市开化县、台州市天台县、舟山市定海区）的叶片为材料，通过对不同的DNA提取方法对比，探讨最优的枫香基因组DNA提取方法;同时对枫香基因组SRAP技术体系进行优化，并将该体系应用于SRAP扩增分析中，研究各群体间的遗传多样性。本试验具体研究结论如下:
　　1.枫香基因组DNA提取方法优化
　　本试验采用改良CTAB法和试剂盒法(Bioteke公司研发的)两种方法对枫香叶片DNA提取结果进行对比，发现两种方法提取的枫香嫩叶DNA在含量和纯度上相差不大，均能满足后续PCR扩增要求。而对于老叶，改良CTAB法提取老叶基因组DNA的产率和纯度均较试剂盒法高。后者不仅含量较低，且含有其他杂质，DNA降解较严重，将对下游PCR反应和其他DNA分子操作产生不利影响。使用改良CTAB提取法有效地解决了枫香树基因组DNA提取中的褐变和多酚、多糖和蛋白质等次生物质干扰等问题。从检测所得纯度可知该DNA模板完全可以用于SRAP分析;另外，该方法还具有成本低、操作简单、省时等特点。
　　2.枫香基因组DNA的SRAP-PCR扩增体系优化
　　采用L16(45)正交实验设计，对影响SRAP-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶和模板DNA用量等5个因素进行了优化，确立枫香树SRAP-PCR最佳反应体系为:总体积20ul，含1×PCR Buffer、1.5 mmol·L-1 Mg2+、0.16 mmol·L-1 dNTPs、0.5umol·L-1引物、0.9 UTaq DNA聚合酶和40 ng模板DNA。SRAP-PCR扩增程序为:95℃预变性5 min，94℃变性30 sec，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，5次循环;94℃变性30 sec，50℃退火30 sec，72℃延伸1 min，30次循环;72℃延伸10 min，4℃保存。结果显示随机选择的引物对随机选择的基因组DNA均可扩增出多态性丰富且条带清晰的DNA片段。说明该SRAP-PCR反应体系稳定可靠，适用于枫香树基因组DNA的SRAP-PCR扩增反应。
　　3.枫香树群体的遗传多样性
　　应用SRAP分子标记的16对引物组合对采自浙江省7个枫香树群体的120个个体样品进行SRAP-PCR分析，共扩增902个条带，其中多态性条带897个，枫香树物种水平上的多态性条带百分率为82.18％，shannon表型多样性指数为0.4935。在群体水平上，多态性条带百分率变化范围为54.29％～74.29％，其均值为66.74％; shannon表型多样性指数的变化范围为0.3199～0.3928，其均值为0.3674。枫香天然群体内和群体间都存在着显著的遗传变异(P＜0.001)，群体间的遗传变异占总变异的15.04％，群体内的遗传变异占总变异的84.96％。
　　4.枫香树天然群体的遗传距离
　　由Nei'指数计算枫香树群体的遗传相似度和遗传距离，结果表明群体的遗传相似度在0.8999～0.9685之间变化。遗传距离在0.1055～0.0320。其中淳安群体与桐庐群体的遗传距离最小为0.0320，而淳安群体和文成群体的遗传距离最大为0.1055。
　　5枫香树天然群体的聚类图
　　根据枫香树种群间的遗传距离，利用UPGMA聚类方法对7个枫香群体进行聚类分析，得出反映各群体间亲缘关系的树状图。可将7个种群分为两大类:第一类中淳安群体和桐庐群体的遗传距离最近，首先聚在一起，再与台州群体聚在一起，最后与生长环境不同的舟山群体聚类;另一类为丽水和文成先聚在一起，再与距离相对较远的开化群体聚在一起。发现枫香树群体的聚类结果与其地理分布格局大致相吻合。

目录

声明

摘要

1 文献综述

1．1 枫香概况

1．1．1 枫香树生态学特性

1．1．2 枫香树的自然分布

1．1．3 枫香树的利用价值

1．2 植物群体遗传多样性的研究

1．2．1 形态学标记的遗传多样性研究

1．2．2 细胞学标记的遗传多样性研究

1．2．3 生化学标记的遗传多样性研究

1．2．4 DNA分子标记的遗传多样性研究状况

1．3 枫香种质资源研究进展

1．3．1 枫香无性繁殖技术

1．3．2 枫香种子的生物学特性研究

1．3．3 枫香人造林与混交林技术

1．3．4 枫香树优株的选择

1．3．5 枫香树的生理生化研究

1．3．6 枫香树园林应用研究

1．3．7 枫香树的遗传多样性研究

2、引言

3、试验材料与方法

3．1 试验材料与试验试剂及试验仪器

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验试剂

3．1．3 试验仪器

3．2 试验方法

3．2．1 试验技术路线

3．2．2 枫香树基因组DNA的提取及DNA质量检测

3．2．3 SRAP-PCR反应条件和正交试验的优化

3．2．4 SRAP引物设计及多态性引物筛选

3．2．5 PCR产物检测

3．2．6 数据统计与分析

4、结果与分析

4．1 2种方法提取枫香树基因组DNA的纯度和产率

4．2 SRAP-PCR扩增体系的分析与确立

4．2．1 SRAP-PCR扩增反应条件确立

4．2．2 正交试验结果分析

4．2．3 SRAP-PCR扩增体系的确立

4．3 SRAP-PCR反应体系稳定性分析

4．4 枫香树天然群体的遗传多样性

4．4．1 枫香树天然群体的遗传多样性分析

4．4．2 枫香树天然群体的遗传分化

4．4．3 枫香树天然群体的遗传距离

5、结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

5．2．1 枫香树基因组DNA的提取方法

5．2．2 枫香树基因组SRAP-PCR反应体系

5．2．3 枫香树天然群体的遗传多样性

致谢

参考文献