PRRSV监测技术平台的建立及其在疫情预警系统中的初步应用

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的严重呼吸系统与繁殖障碍疾病，是目前影响养猪业健康发展的最重要疾病之一。当前国内外采用的PRRS检测方法主要以ELISA及PCR为主。这些方法具有快速、省时等优势，但操作复杂、容易出现假阳性、假阴性。因此，建立一个快速、准确、高通量的检测技术平台用以PRRS流行预警至关重要。本论文以出入境生猪为研究对象，在前人的基础上建立了两种实时荧光PCR方法，并在国内首次建立、报道了PCR-DHPLC检测方法，将其用于出入境生猪PRRS的监控检测，对PRRS预警体系的建立和应用进行了探索，并在PRRS的防控中取得良好效果。
　　1.建立PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法
　　以PRRSV美洲株的GP5基因为靶基因，设计引物，调整PCR体系内各组分及循环参数，最终建立PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法。该方法特异性好，与PCV-2、PRV、CSFV等没有交叉反应；灵敏度高达10个拷贝；重现性良好，各重复样品间扩增曲线拟合程度高。
　　2.建立PRRSV和HP-PRRSV双重TaqMan实时荧光PCR方法
　　以美洲株PRRSV的N蛋白基因、HP-PRRSV的Nsp2基因为靶序列，设计2对引物、探针，分别建立美洲株PRRSV和HP-PRRSV的单一TaqMan探针实时荧光PCR检测方法，并在此基础上进一步研究建立了PRRSV和HP-PRRSV的双重TaqMan探针实时荧光PCR检测方法，可以鉴别检测缺失株与美洲株，特异性好，与PCV-2、PPV、CSFV、SIV、PRV和JEV等无交叉反应；灵敏度高，PRRSV美洲株灵高达9.2个拷贝，HP-PRRSV高达56个拷贝；且重复性较好，批内变异系数小于1％，批间变异系数小于3%。
　　3.首次建立PRRSV PCR-DHPLC方法
　　以PRRSV标准株的GP5基因为靶基因，分别设计克隆用引物和PCR-DHPLC检测用引物，在国内首次建立了PRRSV PCR-DHPLC检测方法，该方法特异性、重现性良好，灵敏度高达10个拷贝/单位，将其用于临床检测表明，PCR-DHPLC与Taqman探针Real-time PCR具有同样的检测灵敏度，能检测出常规RT-PCR不能检出的病料，具有较好的适用性。
　　4.所建立的检测技术平台在 PRRS流行预警中的应用及出入境生猪 PRRS预警体系框架的建立
　　结合本研究所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法、PRRSV和HP-PRRSV单一及双重TaqMan实时荧光PCR法、PCR-DHPLC法以及经典ELISA法构建PRRS监测技术平台，藉此建立进出境生猪PRRS预警体系框架草案，并将其应用于出入境生猪隔离场、养殖场，进行PRRS疫情监控，为PRRS预警体系收集、储备疫情信息，并及时反馈至相关管理部门。较好了解决了PRRS预警系统中监控检测不全面、监控检测措施不当等问题，在PRRS疫情防控中发挥了重要作用。

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中文摘要

第1章 文献综述

1.1 PRRS的病原学及其检测技术研究进展

1.2 PRRS预警体系

1.3本研究的目的、意义

第2章 PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 结论与讨论

第3章 PRRSV 双重TaqMan实时荧光PCR检测方法的建立

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 结论与讨论

第4章 PRRSV PCR-DHPLC检测新技术的建立

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 结论与讨论

第5章 检测技术平台在PRRSV预警体系中的应用

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 结论与讨论

研究总结

参考文献

英文摘要

附录

附录A 进出境生猪PRRS预警体系框架草案

附录B 缩略词表

附录C 攻博期间发表的论文