H2S对干旱胁迫下小麦D1蛋白周转的影响及相关基因的克隆

摘要

干旱是影响作物产量的主要非生物胁迫之一。近年来的研究认为硫化氢（H2S）能够提高植物对干旱的耐受性。为了探索H2S对小麦抗旱性的效应与机理，本文以洛旱6号（耐旱品种）和中国春（干旱敏感型品种）小麦为材料，研究了外源H2S对干旱胁迫下小麦叶绿体PSⅡ光化学活性及D1蛋白周转的影响，对H2S合成关键酶基因TaLCD和TaDCD及D1蛋白降解基因TaDeg1、TaDeg2、TaDeg5、TaDeg7、TaDeg8、TaFtsH1/5、TaFtsH2/8和TaPBCP进行克隆测序，并通过农杆菌介导法将TaLCD和TaDCD进行遗传转化，获得了拟南芥转基因植株。主要实验结果如下：
　　1、H2S缓解了干旱胁迫对小麦幼苗造成的伤害。使用硫氢化钠（NaHS）(一种H2S供体)处理后，与干旱胁迫处理组相比，小麦幼苗长势较好，小麦叶片相对水分含量（RWC）明显增加，硫代巴比妥酸反应物（TBARS）和过氧化氢（H2O2）含量显著降低，过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性显著提高。说明H2S增强了小麦的抗氧化系统，增强了其清除活性氧的能力，缓解了干旱对小麦的氧化胁迫。
　　2、H2S缓解了干旱胁迫对小麦叶片光合作用的抑制。在施加NaHS后，在相同的干旱胁迫下，小麦幼苗的最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ΦPSⅡ）、电子传递速率（ETR）和光化学猝灭系数（qP）均较未施用NaHS的植株显著提高，而非光化学猝灭系数（qN）明显降低，各项荧光参数指标均恢复到接近对照组水平，说明外源硫化氢能够减轻干旱胁迫对植物PSII的损伤，维持PSII的光化学效率，保证光合作用的进行。
　　3、H2S促进了D1蛋白的快速周转，保护了PSⅡ的修复循环。D1蛋白是PSⅡ反应中心最易受损的蛋白。干旱胁迫下，在用NaHS处理以后，与不用NaHS处理相比，D1蛋白含量和磷酸化的D1蛋白含量均显著降低，但转录水平上PsbA基因（D1蛋白合成基因）的表达量明显提高，可能是因为STN8（D1蛋白磷酸化基因）和D1蛋白降解相关基因（Deg1、Deg5、Deg8、FtsH2/8和FtsH1/5）表达显著提高造成的结果。说明H2S通过促进D1蛋白的快速周转缓解了干旱胁迫对PSII的损伤，而不仅仅是提高D1蛋白的含量。
　　4、克隆了H2S合成及D1蛋白周转相关的基因，为了解H2S作用的分子机理提供基础。运用电子克隆技术得到了TaLCD、TaDCD及D1蛋白降解基因TaDeg1、TaDeg2、TaDeg5、TaDeg7、TaDeg8、TaFtsH1/5、TaFtsH2/8和TaPBCP的全长或部分序列，然后根据拟南芥和二穗短柄草中的同源基因设计同源引物，以小麦（中国春）cDNA为模板对这些基因进行了克隆，最终得到TaLCD（1398bp），TaDCD（1263bp），TaDeg1（1284bp），TaDeg2(1803bp)，TaDeg5(936bp)，TaDeg7(3276bp)，TaDeg8(1338bp)，TaFtsH1/5（2063bp），TaFtsH2/8(2022bp)和TaPBCP(969bp)的CDS区序列。将这些基因分别与拟南芥（Arabidopsis thaliana）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）做同源性对比发现，与二穗短柄草的同源性更高。
　　5、分别构建了TaLCD和TaDCD的过表达载体，以拟南芥为受体材料，通过农杆菌介导法对其进行遗传转化，并对遗传转化获得的转基因拟南芥进行了初步鉴定，得到了TaLCD和TaDCD转基因拟南芥的阳性植株，为进一步研究TaLCD和TaDCD的功能奠定了基础。

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1文献综述

1.1干旱对植物的生长和发育的影响

1.2植物中H2S的生物学功能研究

1.3叶绿体D1蛋白及其周转

2引言

3材料和方法

3.1材料与处理

3.2试剂和仪器

3.3试验方法

3.4数据分析

4结果与分析

4.1干旱胁迫下H2S含量的变化

4.2 H2S对小麦幼苗生长和RWC的影响

4.3 H2S对抗氧化酶活性和H2O2含量的影响

4.4 H2S对膜质过氧化作用的影响

4.5 H2S对光系统II光化学效率的影响

4.6 H2S对PsbA基因表达和D1蛋白含量的影响

4.7 H2S对STN8基因及D1蛋白降解相关基因的表达的影响

4.8小麦D1蛋白降解相关基因的克隆

4.9小麦TaLCD和TaDCD的克隆及拟南芥遗传转化

5结论与讨论

5.1外源H2S处理减缓了干旱对小麦造成的氧化胁迫

5.2外源H2S减少了干旱胁迫对PSII的损伤

5.3外源H2S通过促进D1蛋白的周转减缓了干旱胁迫对PSII的损伤

5.4获得了小麦TaLCD和TaDCD基因及D1蛋白降解相关基因TaDeg1、TaDeg2、TaDeg5、TaDeg7、TaDeg8、TaFtsH1/5、TaFtsH2/8和TaPBCP的CDS全长

5.5成功构建了小麦TaLCD和TaDCD基因的过表达载体，获得了转基因拟南芥

参考文献

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