硬蜱耐药基因D6的获得与ReaL-time PCR检测方法的建立

摘要

蜱是一类具有顽强生命力并对环境适应性强的体表寄生虫。是世界第二大生物传播媒介，能够传播多种疾病，可感染动物和人类。在世界范围内广泛存在，对人类自身健康、动物养殖业和自然环境带来严重危害，每年造成巨大的经济损失。当前主要的灭蜱方法有生物防治、化学药物防治、植物源防治、人工防治等，最普遍最主要的防治方法是化学药物防治。长期的化学药物使用，使蜱的某些基因发生突变而导致耐药性，并且化学药物的残留对自然环境和人畜的危害也在不断地加重。为了能够快速、准确、高效的检测出蜱的耐药性，避免化学药物的滥用和减少因化学药物造成的蜱耐药性引起的经济损失，指导临床合理用药，本实验探索建立了快速检测蜱耐药性基因的实时荧光定量PCR检测方法。主要研究的内容和结果如下:
　　1、通过对实验室保存的微小牛蜱的阳性基因组克隆，构建普通PCR方法所需要的阳性标准质粒。通过序列比对设计出普通PCR检测方法和实时荧光定量PCR检测方法所需要的引物和探针。并提取300份来自湖南、甘肃等地的血红扇头蜱、青海血蜱、长角血蜱的基因组作为待测样品。筛选特异性引物和探针，并与普通PCR方法进行敏感性比对。
　　2、构建实时荧光定量PCR的阳性标准质粒，成功建立蜱钠通道耐药性基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR的检测方法。对定量PCR的反应条件和体系进行不断优化，得到较好的扩增效率和线性相关性。并与感染梨形虫的蜱基因组进行特异性试验，显示此方法的特异性较好。阳性检测结果与普通PCR相比，其敏感性是普通PCR的1000倍，表明此方法的敏感性较好。并使用不同浓度梯度的标准阳性质粒进行组内重复性试验和组间重复性试验，结果显示组内重复性变异系数Ct值均小于5％，组间的变异系数均小于10％,表明此方法的重复性、稳定性较好。
　　3、使用本实验建立的实时荧光定量PCR检测方法对来自湖南芷江血红扇头蜱、甘肃临潭青海血蜱、甘肃永靖长角血蜱的300份基因组进行检测。按照TaqMan探针法的阳性标准在300份样品中共检测到263份样品含有钠通道耐药性基因，阳性率为87.67％。蜱种内的阳性分布分别为湖南芷江微小牛蜱的阳性率为8734％(69/79)，湖南芷江血红扇头蜱的阳性率为8750％(63/72)，甘肃临潭青海血蜱的阳性率为92.31％(60/65)，甘肃永靖长角血蜱的阳性率为8452％(71/81)。使用普通PCR检测出来的阳性率为47.0％，使用本实验所建立的实时荧光定量PCR检测方法检测出来的阳性率为8767％阳性符合率为100％。普通PCR检测为阴性的样品中有110份使用荧光定量PCR检测为阳性，从而证明了TaqMan探针实时荧光定量PCR的方法更加可靠和灵敏。使用实时荧光定量PCR的方法检测蜱的耐药性基因在我国尚属首次该方法的建立为准确了解我国蜱虫的耐药状况和指导临床合理用药具有重要意义。

目录

声明

致谢

缩略词表

摘要

第一章 文献综述

1．1 病原学特征

1．2 生活史

1．3 危害

1．4 蜱耐药基因的研究现状

1．5 蜱耐药性诊断方法研究进展

1．5．1 病原学诊断

1．5．2 聚合酶链式反应

1．5．5 实时荧光定量PCR技术

1．6 研究内容与目的

第二章 靶基因的测序分析、引物和探针设计及质粒标准品的构建

2．1 材料

2．1．1 蜱种和参考序列信息

2．1．2 主要试剂和耗材

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 蜱耐药基因D6的序列比对及同源性分析

2．2．2 引物及探针的设计合成

2．2．3 全蜱基因组的提取

2．2．4 质粒标准品的制备

2．3 结果与分析

2．3．2 基因的扩增、克隆及测序

2．4 讨论

第三章 实时荧光定量PCR方法的建立及评价

3．1 试剂材料

3．2 方法

3．2．1 实时荧光定量PCR扩增

3．2．2 荧光定量PCR标准曲线的建立

3．2．3 TaqMan探针荧光定量PCR方法的评价

3．3 结果与分析

3．3．1 标准曲线的建立

3．3．2 特异性实验

3．3．3 敏感性实验

3．3．4 重复性实验

3．4 讨论

第四章 我国部分地区蜱虫耐药基因D6荧光定量PCR检测

4．1 材料

4．2．2 探针及引物的合成

4．2．3 普通PCR检测体系与程序

4．2．4 荧光定量POR检测体系与程序

4．3 结果

4．3．1 蜱耐药基因D6普通PCR检测结果

4．3．2 蜱耐药基因D6荧光定量PCR检测结果

4．4 普通PCR结果和实时荧光PCR检测结果比较

4．5 讨论

第五章 全文结论

参考文献

作者简历