小麦钙依赖性蛋白激酶TaCPK34在干旱胁迫和淀粉合成中的功能

摘要

钙依赖蛋白激酶(CPK)家族在调控植物生长、发育与物质合成等过程中发挥了重要功能。然而，一些CPKs成员生物学功能尚未阐明。在本课题组前期研究发现，钙依赖性蛋白激酶TaCPK34在小麦籽粒灌浆期间高表达。因此，推测TaCPK34在籽粒灌浆期发挥了重要功能。为了证实上述猜测，本研究从小麦中首次克隆到TaCPK34基因，对基因的序列和特性进行分析:利用大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默技术(BSMV-VIGS)研究了TaCPK34功能的研究。主要结果如下:
　　(1)本研究分离出TaCPK34基因的cDNA序列，它编码了518个氨基酸，包含了CPKs家族所共有的四个保守结构域。进化树比对结果显示，该激酶属于CPKs第Ⅱ亚族。农杆菌介导瞬时转化烟草叶片结果表明，它定位在细胞膜上，具有钙依赖性蛋白激酶的特征。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)测定结果表明，在20％PEG6000诱导的水分胁迫、100μM脱落酸(abscisic acid，ABA)、100μM茉莉酸甲酯(jasmonic acid，JA)和100μM水杨酸(salicylic acid，SA)等处理后，编码该激酶基因的转录水平显著升高，暗示它参与了小麦干旱胁迫过程，并受ABA和JA等激素调控。
　　(2)利用BSMV-VIGS技术获得BSMV-VIGS-TaCPK34短暂性沉默小麦植株。自然干旱胁迫14d后，发现TaCPK34基因沉默小麦植株对干旱胁迫更为敏感，从而负向验证了该激酶在小麦干旱胁迫响应中发挥了重要作用。利用iTRAQ蛋白质组学技术辨析了干旱胁迫BSMV-VIGS-TaCPK34沉默小麦植株中的差异蛋白，共辨析出39个蛋白的表达丰度表现出显著差异(≥1.50或≤0.68fold，P＜0.05)，这些蛋白参与了胁迫与防御、碳水化合物代谢、核苷酸代谢、光合作用、运输、蛋白代谢和信号转导等多种功能，推测TaCPK34可能参与调控这些蛋白的表达，进而提高了小麦对干旱的抗性。
　　(3)在大田条件下对灌浆期小麦穗部进行BSMV-VIGS-TaCPK34病毒接种，以探究TaCPK34在小麦淀粉合成过程中的功能。结果显示，在花后15d、20d、26d和30d，BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株中TaCPK34基因表达量受到显著抑制（63.8％-97.8％）;BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株成熟籽粒淀粉含量、千粒重、粒长和粒宽均显著降低（降幅分别为6.0％、7.1％、4.4％和11.0％）;扫描电镜观察发现BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株成熟籽粒内淀粉粒排列疏松且数量减少。这些结果表明TaCPK34可能参与了小麦淀粉合成的调控。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 钙依赖性蛋白激酶

1．2 钙依赖性蛋白激酶研究进展

1．3 BSMV-VIGS技术在作物中应用进展

1．3．2 BSMV-VIGS技术在小麦中的应用

1．4 iTRAQ蛋白组学研究技术

1．5 本研究的目的和意义

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 试验所用菌株及质粒载体

3．1．3 试验所用试剂及仪器

3．2 试验方法

3．2．1 试验材料的种植与处理

3．2．2 培养基及其他溶液的配制

3．2．3 RNA的提取与cDNA第一链的合成

3．2．4 TaCPK34基因全长和启动子的克隆与分析

3．2．5 TaCPK34亚细胞定位

3．2．6 不同激素处理小麦幼苗

3．2．7 BSMV-VIGS-TaCPK34基因沉默载体的构建和病毒的产生

3．2．8 小麦苗期基因沉默

3．2．9 iTRAQ蛋白组学

3．2．10 大田小麦穗部基因沉默

4 结果与分析

4．1 TaCPK34基因序列的获得与蛋白结构域的预测

4．1．1 TaCPK34基因全长的克隆

4．1．2 TaCPK34蛋白结构域预测及进化树分析

4．2 TaCPK34亚细胞定位

4．3 TaCPK34基因启动子序列分析及不同激素响应

4．3．1 TaCPK34基因启动子序列的获得与功能元件预测

4．3．2 TaCPK34对不同激素的响应

4．4 TaCPK34在干旱胁迫下的响应机制

4．4．2 BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株对干旱胁迫的响应

4．5 TaCPK34调控蛋白的辨析

4．6 TaCPK34在籽粒淀粉合成过程中的作用

4．6．2 BSMV-VIGS-TaCPK34沉默小麦植株籽粒表型的鉴定

5 结论与讨论

5．1 TaCPK34的特性

5．2 TaCPK34在小麦响应干旱胁迫过程中的功能

5．3 TaCPK34在小麦籽粒淀粉合成过程中的功能

6 本研究主要结论、创新点及下一步研究计划

6．1 主要结论

6．2 本研究创新之处

6．3 下一步拟研究内容

攻读硕士学位期间发表文章及获得荣誉情况

参考文献