FoxO1ΔDBD对瘦素作用的影响

摘要

瘦素是能量代谢领域的一个重要发现，而FoxO1在瘦素信号传导途径中起负反馈作用。为了提高瘦素敏感性，本实验室构建了FoxO1的突变体FoxO1△DBD。然而其在瘦素介导的能量代谢作用机制并不清楚。
　　为探究FoxO1△DBD对瘦素作用的影响，本论文从以下几个方面进行了实验研究:
　　1.构建重组质粒pEF1α-myc-FoxO1△DBD，并将其转染于293Rb细胞，应用Western blotting检测突变体FoxO1△DBD的表达。试验成功构建了重组质粒pEF1α-myc-FoxO1△DBD，并在293Rb细胞中检测到了突变体FoxO1△DBD的表达;
　　2.采用DNA原核显微注射的方法制备含有突变体FoxO1△DBD的转基因小鼠模型，以鼠尾基因组DNA为模板采用PCR鉴定基因型，获得了10只首建鼠，建立了10个繁育系，并建立了高G-C含量PCR的基因型鉴定方法成功地应用于首建鼠到F5代小鼠;
　　3.采用荧光定量PCR和免疫共沉淀方法检测了FoxO1△DBD在转录水平和翻译水平的表达，成功地检测出FoxO1△DBD基因的表达;
　　4.对FoxO1△DBD转基因鼠进行了表型分析，结果显示该小鼠在普通饮食情况下和高脂饮食情况下，与野生型鼠相比，转基因鼠的能量消耗较高;在普通饮食再投喂时，从整体趋势上看，转基因鼠的能量代谢调节的能力较好;在普通饮食情况下，与野生型小鼠相比，转基因小鼠能够更快地调节血糖浓度，具有较强的葡萄糖耐受能力和对胰岛素敏感性较好;在普通和冷刺激情况下转基因鼠的UCP1的表达水平变化和直肠温度相互印证;通过代谢笼实验分析体重和食物的摄取量基本变化不大，转基因鼠的氧气消耗量，二氧化碳生成量和产热值大都低于野生型公鼠，且在夜间时段有多个位点呈现显著差异;转基因鼠的呼吸交换率，动态的行为和总的行为活动，两者趋势一致，在夜间均呈现升高趋势，但是野生型鼠的高峰高于转基因鼠的，且野生型鼠的下降迅速，以至于转基因鼠在白天呈现高于野生型公鼠，且存在显著差异表明了转基因鼠的能量消耗较高;从自噬相关基因的转录表达水平，tfEB基因表达的转录水平于UCP1一致，与预期不符，表明未检测到自噬作用对转基因小鼠能量消耗的影响;
　　5.构建了三个重组质粒pGL3-CD36启动子，转染HepG2细胞，并检测了pGL3-CD36启动子活性，结果显示pGL3-CD36启动子没有活性;6.构建了重组质粒pCMV5-myc-PPARγ，转染HepG2细胞，应用Western blotting检测PPARγ的表达，并检测了pGL3-SRBⅠ的启动子活性。结果在HepG2细胞检测到了PPARγ的表达。在瘦素刺激下pGL3-SRBⅠ的启动子活性下降。综上所述，FoxO1△DBD对瘦素作用产生了影响，FoxO1△DBD能够提高动物的能量代谢，胰岛素敏感性，葡萄糖耐受性和线粒体解耦联水平，为研究FoxO1△DBD的功能及作用机制奠定了基础，为治疗糖尿病，肥胖症等能量代谢疾病的治疗靶点提供理论依据。

目录

声明

致谢

摘要

1．文献综述

1．1 瘦素的研究进展

1．1．1 瘦素的发现

1．1．2 瘦素的功能

1．1．3 瘦素细胞信号转导机制

1．1．4 瘦素抵抗及其机制

1．2 叉头型转录因子1(FoxO1)的研究进展

1．2．3 FoxO1的功能

1．3 棕色脂肪组织非颤栗性产热的研究进展

1．3．1 非颤栗性产热的定义

1．3．2 棕色脂肪组织概述

1．3．3 解耦联蛋白家族(UCPs)概述

1．3．4 影响棕色脂肪组织非颤栗性产热的因素

1．3．5 FoxO1与UCPs

1．4 自噬的研究进展

1．4．1 自噬的定义

1．4．2 自噬的机制

1．4．3 自噬的功能

1．5 B族清道夫受体与过氧化物酶增殖物激活受体γ

1．5．1 B族清道夫受体(SRB)

1．5．2 过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)

1．5．3 过氧化物酶体增殖物激活受体γ与B族清道夫受体的关系

2．引言

3．材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物及饲粮

3．1．2 菌种与质粒

3．1．3 实验主要试剂

3．1．4 实验主要仪器

3．1．5 实验常用溶液配方

3．1．6 实验引物汇总

3．2 实验方法

3．2．1 FoxO1ΔDBD载体的构建及在细胞中的暂时表达

3．2．2 FoxO1ΔDBD转基因小鼠的构建及繁育

3．2．3 FoxO1ΔDBD转基因小鼠基因型鉴定方法的建立

3．2．4 检测FoxO1ΔDBD在转基因小鼠体内的表达

3．2．5 FoxO1ΔDBD转基因小鼠的体重和采食置

3．2．7 不同条件下FoxO1ΔDBD转基因小鼠的UCPs的转录水平

3．2．9 冷刺激情况下FoxO1ΔDBD转基因小鼠的温度变化

3．2．10 代谢笼试验

3．2．11 自噬相关基因的转录表达水平

3．2．12 清道夫受体CD36启动子荧光素报告基因载体构建

3．2．13 过氧化物酶增殖物激活受体γ表达载体构建及表达

4．结果与分析

4．3 PCR法鉴定FoxO1ΔDBD转基因小鼠的基因型的建立

4．4 FoxO1ΔDBD在转基因小鼠体内的表达

4．5 FoxO1ΔDBD转基因小鼠的体重和采食量

4．5．1 普通饮食情况下FoxO1ΔDBD转基因小鼠的体重和采食量

4．5．2 高脂饮食情况下FoxO1ΔDBD转基因小鼠的体重和采食量

4．5．3 普通饮食再投喂FoxO1ΔDBD转基因小鼠的体重和采食量

4．6 普通饮食情况下FoxO1ΔDBD转基因小鼠的葡萄糖稳态与胰岛素耐受性

4．7 不同条件下FoxO1ΔDBD转基因小鼠的UCPs的转录表达水平

4．8 FoxO1ΔDBD转基因小鼠的UCP1的翻译表达水平

4．10 FoxO1ΔDBD转基因小鼠的代谢笼试验

4．11 不同条件下FoxO1ΔDBD转基因小鼠的自噬相关基因的转录表达水平

4．12 清道夫受体CD36启动子荧光素报告基因载体构建

4．12．1 清道夫受体CD36启动子序列扩增

4．12．2 pMD19-T-CD36启动子载体鉴定

4．12．3 pGL3-CD36启动子载体构建及鉴定

4．12．4 pGL3-CD36启动子活性检测

4．13．2 pCMV5-myc-PPARγ表达载体构建及鉴定

4．13．3 pCMV5-myc-PPARγ在HepG2细胞内表达

4．13．4 pGL3-SRB Ⅰ启动子活性检测结果

5 讨论与结论

5．1 讨论

5．2 结论

参考文献