烟叶成熟期GS同工酶表达特性与氮素运转的关系

摘要

采用Native-PAGE和Blue-native PAGE技术结合活性染色研究了烤烟叶片两种谷氨酰胺合成酶(GS)同工酶的聚体形式和相对分子量。采用RT-PCR技术测定烟叶叶肉和主脉GS同工酶的基因表达丰度，采用Western-blot技术结合灰度分析测定烟叶叶肉和主脉GS同工酶的蛋白亚基含量，并通过观察叶绿体超微结构和测定叶绿素含量、氮代谢相关酶活性、烟叶氮代谢物含量、质外体相关生理指标和氨气挥发量等方法，研究了不同耐肥性烤烟品种叶片成熟期氮素代谢特征及差异，探讨了叶片GS同工酶的活性和氮素代谢相关指标的关系。同时利用GS同工酶蛋白亚基含量和相关生理指标在烟叶成熟期的动态变化，对南阳烟区三个烤烟新品种的适宜氮用量进行了探究。结果表明:
　　1、各品种编码主脉和叶肉的GS1同工酶的基因NtGS1在进入衰老之后表达丰度均明显升高，叶龄45d后均表现为NC89＞K326＞豫烟10号，GS2同工酶基因NtGS2在衰老启动时表达量就大幅降低，之后随着叶龄的增长呈逐步下降趋势，成熟期氮低效品种豫烟10号的NtGS2表达丰度更是低于中等氮效率品种K326和氮高效品种NC89。Native-PAGE和Blue-native PAGE技术结合活性染色的结果表明烤烟叶片GS1和GS2同工酶具有相同的聚体方式，且相对分子量约为440kD。Western-blot结果表明烤烟叶片的叶肉中主要以GS2同工酶为主，其蛋白亚基含量随着叶龄的增长逐渐下降，与叶绿体降解的规律相吻合。叶脉中GS1同工酶占据主导地位，其蛋白亚基含量自叶龄45d始大幅增加，随后呈先升高后降低的趋势。叶肉和主脉的GS同工酶蛋白亚基含量动态变化及品种间差异与基因表达丰度的变化和差异较为接近。烤烟叶片叶肉和主脉中的GS同工酶分别与氮代谢相关酶活性、氮代谢物含量、质外体相关生理指标和氨气挥发量呈显著或极显著的相关性，说明不同烤烟品种GS同工酶的表达差异可能导致成熟期氮高效品种源库间的“源库强差”高于氮低效品种，且氮高效品种叶绿体降解速度慢，衰老降解的氮素被大量再利用，NH4+向质外体转移量较少，氨气挥发量小。而成熟期氮低效品种叶片两种GS同工酶活性在各叶龄时期均较弱，氮代谢物在源库间转运效率和同化能力均较低，致使衰老降解的氮素大量向质外体转移并以氨气的形式挥发出去，实现了自身的氮素调亏。源库之间的压力差和质外体生理上的不同综合导致了不同基因型烤烟成熟期氮素利用效率的差异。
　　2、南阳烟区3个参试品种氮代谢特性存在明显差异。NC71成熟期GS1、GS2和硝酸还原酶(NR)活性较低，谷氨酸脱氢酶(GDH)活性较高，具有较低的氮素同化和再利用能力，同时质外体NH4+浓度和氨气挥发量均较高，说明该品种可以通过氨气挥发的形式实现氮素调亏，在高氮的情况下依然保持相同的变化趋势，因此成熟期叶片总氮和游离氨基酸含量较低，证明其具有较低的成熟期氮效率。同时NC71烤后样在高氮条件下钾氯比较高，糖碱比处于适宜范围，同时氮碱比也接近1;其燃烧性、劲头和柔细度以及经济性状均明显优于其它处理。因此应在较高的肥力条件下种植。而云烟99成熟期具有较高的GS同工酶和NR活性，衰老降解的氮素被大量同化再利用，叶片氮代谢物含量较高，同时具有较低的氨气挥发量。云烟99中部叶烤后样在低氮条件下综合品质最好，此时糖碱比和钾氯比较高，氮碱比最接近1;经济性状和感官质量评价中灰色、燃烧性、劲头和柔细度明显好于中氮和高氮处理。因此宜适当减少氮肥用量。渠首1号氮代谢特性居于两品种之间，且常规化学成分、感官评价和经济性状均在中等氮用量条件下表现最优，因此宜在中氮条件下种植。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 烤烟氮素营养研究现状

1．1．1 氮素营养和烤烟产量、品质的关系

1．1．2 烤烟碳氮代谢的关系

1．2 谷氨酰胺合成酶(GS)研究进展

1．2．1 GS同工酶的种类、组装、定位及功能

1．2．2 GS同工酶时空分布的研究进展

1．2．3 GS同工酶基因表达的研究进展

1．2．4 GS同工酶与氮素利用效率的关系

1．3 植物氮效率的基因型差异及原因

1．3．1 氮效率的基因型差异

1．3．2 氮效率差异的生理与分子基础

1．4 植物叶片氨挥发研究进展

2 引言

3 材料与方法

3．1 试验材料与设计

3．2．2 GS同工酶相对分子量及聚合方式的测定

3．2．3 GS同工酶蛋白亚基的测定(Western-blot)

3．2．4 氮代谢相关酶活性的测定

3．2．6 质外体的提取与测定

3．2．7 氨气挥发量的测定

4 结果与分析

4．1 烟叶成熟期GS同工酶的表达差异及其与氮素代谢的关系

4．1．1 烟叶成熟期叶片超微结构和叶绿素含量动态变化

4．1．2 烟叶成熟期GS同工酶基因表达的差异分析

4．1．3 烟叶成熟期GS同工酶蛋白亚基含量的差异分析

4．1．4 烟叶成熟期氮代谢酶活性的变化动态

4．1．5 烟叶成熟期NH4+浓度、总氮和可溶性蛋白含量的变化动态

4．1．6 烟叶成熟期质外体相关生理指标和氨气挥发量的动态变化

4．1．7 烟叶成熟期GS同工酶的蛋白亚基含量与生理指标的相关性分析

4．2 GS同工酶活性与烤烟品种适宜氮用量研究

4．2．1 施氮量对烟叶成熟期GS同工酶蛋白亚基含量的影响

4．2．2 施氮量对烟叶成熟期总氮和游离氨基酸含量的影响

4．2．3 施氮量对烟叶成熟期氮代谢酶活性的影响

4．2．4 施氮量对烟叶成熟期质外体铵离子浓度和氨气挥发量的影响

4．2．5 施氮量对烟叶化学成分含量的影响

4．2．6 施氮量对烟叶感官质量评价的影响

4．2．7 施氮量对不同烤烟品种经济性状的影响

5 讨论

5．1 烟叶成熟期GS同工酶的表达差异及其与氮素代谢的关系

5．1．2 烟叶成熟期GS同工酶活性的差异

5．1．3 烟叶成熟期GS同工酶相对比活力的差异

5．1．4 烟叶成熟期氮代谢酶活性的差异

5．1．5 烟叶成熟期氮代谢物含量的差异

5．1．6 烟叶成熟期质外体生理指标及氨气挥发量的差异

5．1．7 小结

5．2 GS同工酶活性的测定与烤烟品种适宜氮用量研究

5．2．1 不同氮用量条件下品种氮代谢特性的差异

5．2．2 不同氮用量条件下品种常规化学成分、感官质量和经济性状的差异

5．2．3 小结

6 结论

参考文献