新型功能分子BST2单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用

摘要

BST2(Bone Marrow Stromal Antigen2)骨髓基质细胞抗原2，又被称为CD317，HM1.24或者 tetherin，是天然免疫中针对囊膜病毒的应答因子。BST2的 cDNA是从由风湿性关节炎衍生出的一种滑液细胞系中克隆出来，当时被认为BST2蛋白参与了前体B细胞生长。BST2能够将vpu蛋白缺失的HIV-1病毒粒子拴在细胞膜上，阻止病毒的释放，BST2因此被命名为“tetherin”。BST2对囊膜病毒的出膜具有广谱的抑制作用，是抗击囊膜病毒疾病的一种天生固有的免疫方式。BST2有如此广谱的抑制病毒作用的原因之一，在于这些病毒都具有源于宿主细胞双层脂膜的囊膜结构，BST2能够通过在病毒出细胞膜时直接拴住病毒而起到抑制作用，而近期研究发现，BST2还具有促进某些病毒进入细胞的功能。随着对 BST2功能和结构的不断了解，必将在相关药物开发及疾病控制中发挥更大的作用。
　　本实验利用分子生物学手段，通过软件预测，根据已知的 BST2基因序列设计出特异性引物，通过 PCR技术扩增得到 BST2的基因片段，经过琼脂糖电泳及测序证明我们正确扩增到BST2339bp的基因片段。设计了扩增质粒和表达质粒，将 BST2基因片段克隆至质粒中，质粒鉴定正确后，转化至 BL21a大肠杆菌表达系统，可溶性表达了 BST2的蛋白。镍离子亲和层与凝胶层析纯化蛋白后，测定了蛋白浓度，使抗原达到免疫实验要求。三次免疫 Balb/C小鼠，加强免疫后采小鼠脾细胞与复苏的SP2/0细胞株进行融合。经过三个克隆阶段，成功制备了2株鼠源单克隆抗体(McAb)，命名为10-1和11-1。经测定效价均为107，Westernblot方法及表面等离子共振技术对其特异性及亲和力等特性进行了检测，结果显示这两株单抗具有较好的特异性和较高的亲和力。采集并分离了HIV感染病人及正常人的外周血，并分离得到了外周血单核细胞(PBMCs)。通过流式细胞技术，利用单克隆抗体及绿色荧光 FITC标记的二抗共染了外周血单核细胞，比较了 BST2蛋白在 HIV感染病人与正常人外周血单核细胞中的表达差异。初步结果显示，感染后人外周血单核细胞表面 BST2表达量比正常人血液中的低。
　　BST2蛋白表达、单克隆抗体制备及检测方法的初步应用，为进一步揭示BST2蛋白作用机制、功能及抗病毒药物开发提供详实数据及方法。

目录

第1章 新型功能分子BST2研究进展

1.1 BST2的结构

1.2 BST2对囊膜病毒的抑制作用

1.3 病毒对BST2的拮抗作用

1.4 BST2协助人巨细胞病毒（HCMV）进入细胞

1.5 BST2在天然免疫中可能扮演的其他角色

1.6 展望

第2章 BST2基因克隆、表达及纯化

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

第3章 BST2单克隆抗体的制备及纯化

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第4章 外周血BST2表达的初步检测

4.1材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

第5章 结 论

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果