毛脉酸模内生真菌体外抗肿瘤活性菌株筛选及其生物学特性研究

摘要

毛脉酸模(Rumex gmelini Turcz.)为蓼科酸模属植物。民间以根入药，对淋病、上呼吸道感染性疾病、癣病和疮毒有确切疗效，具有抗肿瘤、抗真菌、镇咳平喘、降压、抗病毒和抗氧化等作用。内生真菌(endophytic fungus)是指生活在健康植物的各种组织和器官内部的真菌，被感染的植物不表现出明显的外在病症，可通过组织学方法、从严格表面消毒的植物组织中分离的方法以及从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生性。本文对毛脉酸模内生真菌进行了以下研究: (1)毛脉酸模内生真菌体外抗肿瘤活性菌株的筛选 本实验用分离得到的16株毛脉酸模内生真菌对LOVO、SGC-7901、MCF-7、SMMC-7721、MGC-803、A549、SK-OV-3、HeLa8株人体肿瘤细胞进行了体外抗肿瘤实验。运用MTT法进行实验，记录结果，采用SPSS16.0软件进行分析。筛选得到了4株抗肿瘤效果的内生真菌，其中菌RGT-S12对MCF-7，LOVO，SK-OV-3细胞具有显著的抑制作用。菌RGT-S31对A549，MGC-803，HeLa细胞具有显著的抑制作用。菌RGT-S42对SGC-7901，LOVO，SK-OV-3细胞具有显著的抑制作用。菌RGT-S44对SMMC-7721，MGC-803，A549和HeLa细胞具有显著的抑制作用。 (2)对筛选得到的毛脉酸模内生真菌进行分子鉴定 通过对所筛选出的3株菌进行rDNA扩增、测序及遗传进化的分析，并结合前期基础的形态鉴定，结果表明，菌RGT-S31为镰刀孢属Fusarium oxysporum，菌RGT-S42小尾孢属（Cercosporella）真菌，菌RGT-S44为镰刀属uncultured Fusarium真菌。 (3)筛选得到的毛脉酸模内生真菌生物学特性研究 通过改变不同培养条件对所筛选出的4株内生真菌进行培养特性研究，结果表明:菌RGT-S12在PDA培养基生长最快;最适宜PH值为6，最适温度为30℃;可以很好的利用乳糖和淀粉为碳源，利用KNO3为氮源。菌RGT-S31在四种培养基上均能较好的生长;最适生长pH值为pH8，最适温度为30℃;可以很好的利用麦芽糖为碳源，利用KNO3为氮源。菌RGT-S42在基本培养基能较好的生长，在查氏培养基上生长缓慢;的最适生长pH值为pH5，最适温度为25℃;可以很好的利用木糖为碳源，利用蛋白胨和NH4N03为氮源。菌RGT-S48在PDA培养基能较好的生长，在查氏培养基上生长缓慢;最适生长pH值为pH7，最适温度为30℃;可以很好的利用果糖为碳源，利用NaN03为氮源。 本实验进行了毛脉酸模内生真菌体外抗肿瘤实验，筛选出4株有体外抗肿瘤效果的内生真菌，并对筛选得出的内生真菌进行了鉴定和培养特性研究，为开发毛脉酸模内生真菌资源和寻找新的抗肿瘤药物提供依据。

目录

摘要

前言

第一章文献综述

1．蓼科酸模属药用植物的研究进展

2．毛脉酸模的研究进展

2．1资源分布及利用

2．2生药学研究

2．3质量标准研究

2．4指纹图谱的研究

2．5化学成分研究

2．6微生物学研究

2．7生态学研究

2．8毛脉酸模中主要成分的药效学和临床研究

2．9药理作用研究

3．植物内生真菌的研究进展

3．1内生真菌的作用

3．2内生真菌的的生物多样性

3．3内生真菌的活性成分研究

3．4内生真菌产抗肿瘤类活性物质

3．5从内生真菌中寻找有用次生代谢产物的理论基础

3．6植物内生真菌研究在药用植物资源保护与新资源开发利用中的重要作用

4．本课题研究内容和意义

4．1实验的主要内容

4．2研究的目的意义

第二章毛脉酸模内生真菌体外抗肿瘤菌株筛选

1．实验材料与设备

1．1实验材料

1．2细胞株

1．3试剂

1．4仪器与设备

2．实验方法

2．1毛脉酸模内生真菌化学成分的提取

2．2肿瘤细胞的复苏

2．3肿瘤细胞的培养与传代

2．4 MTT法测定内生真菌醇提物对肿瘤细胞的抑制作用

2．5计算肿瘤抑制率

2．6实验数据处理

3实验结果与分析

3．1菌RGT-S12醇提物对人肿瘤细胞增殖的影响

3．2菌RGT-S31醇提物对人肿瘤细胞增殖的影响

3．3菌RGT-S42醇提物对人肿瘤细胞增殖的影响

3．4菌RGT-S44醇提物对人肿瘤细胞增殖的影响

4本章小结

第三章毛脉酸模抗肿瘤活性内生真菌的分子鉴定

1实验材料与设备

1．1植物样品和菌株

1．2培养基

1．3实验仪器

1．4实验试剂

1．5溶液的配制

2实验方法

2．1内生真菌基因组DNA的提取

2．2内生真菌基因组DNA的检测

2．3内生真菌ITS序列的扩增

2．4 PCR扩增产物的序列测定与数据处理

3相关菌株分子鉴定的结果

3．1内生真菌基因组DNA提取结果

3．2内生真菌ITS序列PCR扩增结果

3．3毛脉酸模抗肿瘤活性内生真菌的分子鉴定结果

4．本章小结

第四章毛脉酸模抗肿瘤活性内生真菌生物学特性研究

1实验材料

1．1植物样品和菌株

1．2培养基

2实验方法

2．1抗肿瘤活性毛脉酸模内生真菌培养特性的研究

3实验结果

3．2菌RGT-S31的培养特性研究结果

3．3菌RGT-S42的培养特性研究结果

3．4菌RGT-S44的培养特性研究结果

4．本章小结

第五章综合结论

参考文献

致谢

声明

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