20℃条件下氯胺酮对大头金蝇生长发育影响及其量效关系

摘要

目的:近年来，涉毒死亡相关案件逐年增多。而在怀疑中毒死的高度腐败或白骨化尸体上，利用昆虫毒理学推断死后经历时间（postmortem interval， PMI）已成为法医学死亡时间推断的一种必要手段。课题组前期研究发现在不同的环境温度（32℃、28℃、24℃）条件下，氯胺酮能不同程度延缓大头金蝇生长发育速度，延长发育历期，这种影响与环境温度、氯胺酮剂量和两者之间的交互作用均有关。但氯胺酮在较低温度条件下，对大头金蝇生长发育影响尚无定论。因此，我们通过观察20℃时氯胺酮对大头金蝇生长发育影响的效果，探讨温度、药物二者对大头金蝇生长发育影响及量效关系，以期为较低温度条件下推断PMI提供法医昆虫毒理学依据。
　　方法:将河南科技大学校园采集的大头金蝇在室内饲养至第三代作为母代育种组饲养。将新鲜的猪肉搅碎混入煮沸的琼脂糖粉、蒸馏水中制成培养基，按氯胺酮半数致死量（50 mg/kg）计算，分别向培养基内加入0、0.5倍、1倍、2倍半数致死量的氯胺酮，充分混匀后低温静置保存，分别标记为K0、K1/2、K1、K2。室温下用新鲜猪肉诱使育种组产卵，将0.5 h内所产卵块称重后随机均分为4份，随机接种后将培养基置入20℃恒温室内孵育，湿度（75±10）％，光照周期设为12 h:12 h。卵块孵化后16 h随机取样，每隔12 h留取一次直至成蛹，分别用于生长发育指标观察和幼虫体内药物检测。（1）测量各发育历期蝇体长、体重(-X±SD)，绘制生长曲线。以蝇卵孵化的时间作为大头金蝇发育历期零点，记录产卵时间、孵化时间、离食时间、化蛹时间和羽化时间，计算发育积温和羽化率。重复以上实验。（2）将留测样品解冻，在研磨皿中研碎，加盐酸、石油醚震荡，离心去除上清液，碱化后氯仿萃取，待萃取液浓缩后加入内标利多卡因，再用无水乙醇定容至100μL，以利多卡因为内标，SIM方式进样用GC-MS技术检测虫体内氯胺酮含量。使用SPSS18.0软件处理分析数据，应用单因素方差分析和新复极差检验法探讨氯胺酮与20℃低温对大头金蝇生长发育影响量效关系。
　　结果:20℃条件下大头金蝇生长发育各项观察指标及幼虫体内氯胺酮检测结果如下：
　　一、生长发育指标观察
　　（1）体长、体重变化。各组大头金蝇幼虫均在32 h左右孵化，孵化后16、28、40、52小时 K0、K1/2、K1、K2各组体长、体重无统计学差异。64~76 h时体长K1/2＞K1＞K2＞K0，88~124 h时体长大小K1/2＞K0＞K1＞K2，第136 h各组之间体长无差异；64 h时体重K0＞K1/2＞K1＞K2；76~136 h时，体重大小依次是K1/2＞K0＞K1＞K2；148~196 h（至离食期）体长、体重均为K1＞K0＞K1/2＞K2。各组在196 h时体长均达到最大值，四组间最大平均体长有显著差异（P＜0.05），其分别是15.34±0.74 mm、14.69±0.94 mm、15.95±1.21 mm、13.72±0.41 mm，其体长增长速度分别为0.071 m/h、0.06475 m/h、0.073 m/h、0.0615 m/h。K0、K1于184 h到达最大体重，K1/2、K2于196 h到达最大体重，4组最大体重分别为102.57±2.32 mg、93.41±1.12 mg、115.11±1.73 mg、90.46±2.74 mg，其体重增长速度分别为0.0685 mg/h、0.5306 mg/h、0.6830 mg/h、0.5008 mg/h。
　　（2）发育历期变化。各组大头金蝇均在产卵后32 h孵化，以孵化时间为零点，离食时间：K0、K1、K2在产卵后196 h，K1/2组在184 h；化蛹时间：K0、K1/2、K1均为232 h，K2组234 h；羽化时间：各组依次为484 h、489 h、486 h、494 h；总发育历期：各组分别为516 h、521 h、518 h、526 h。其中，卵期最短，蛹期最长，各阶段的发育历期由长到短的次序为蛹期、幼虫期、离食期、卵期。4组孵化时间相同，K0组在196 h离食。K1/2组幼虫离食期比对照组延长12 h，但K1、K2组与对照组无明显差异。与对照组相比，蛹期实验组分别延迟5 h、2 h、8 h，总发育历期分别延迟5 h、2 h、10 h。
　　（3）发育积温和羽化率。从产卵至羽化，20℃条件下，各组大头金蝇积温分别为2580、2605、2590和2630 ADH。实验组的平均发育积温较对照组分别增加了25、10和50 ADH。各组羽化率分别为69%、65%、58%、40%，3个实验组的平均羽化率为53%。与对照组相比，其下降16%。四组间无统计学差异（P＞0.05）。
　　二、虫体内氯胺酮的含量及变化规律
　　盐酸氯胺酮的检测限为0.1μg/mL(信噪比>3)，线性范围为5～3000μg/mL，回归方程为：y=0.0714x+0.4051 R2=0.9983( n=5)。100、500、1000μg/mL三个浓度盐酸氯胺酮溶液检测方法的回收率，分别为97.6%，93.6%和93.5%，在88、112、124、136、160、184 h时间段中，虫体氯胺酮含量，均在160 h达最大峰，其曲线峰型呈先升高后降低。
　　结论:本课题研究获得20℃条件下氯胺酮对大头金蝇体生长发育影响的数据，建立了大头金蝇幼虫检材中氯胺酮的GC/MS快速提取、检测方法。研究结果表明，在实验剂量范围内，氯胺酮对大头金蝇生长发育速度、发育历期均存在一定的影响，且这种影响与幼虫体内氯胺酮残余量间存在一定程度的相关性，实验组表现为氯胺酮残留量越大，抑制作用越明显，这可能与氯胺酮在蝇体内的代谢有关。

目录

符号表

第1章 法医昆虫毒理学

1.1概述

1.2影响昆虫生长发育的因素

1.3法医昆虫毒理学在药毒物检测领域的展望

第2章 生物检材内氯胺酮检测技术

2.1氯胺酮概述

2.2氯胺酮分布及代谢

2.3生物检材中氯胺酮检测方法

2.4小结

第3章 20℃条件下氯胺酮对大头金蝇的生长发育影响

3.1引言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4结果

3.5讨论

第4章 大头金蝇幼虫体内氯胺酮的含量及变化规律

4.1引言

4.2实验原理

4.3实验材料

4.4实验方法

4.5结果

4.6讨论

第5章 结论

参考文献

缩略语词汇表

附录A 附录 图

附录B 附录 表

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果