转膜肽TAT滞育激素融合肽及其转基因烟草对棉铃虫幼虫的生长抑制作用

摘要

滞育是一些昆虫在准备抵抗不利条件时表现出来的生长停滞，滞育激素（DH）起诱导或解除滞育的作用取决于昆虫的种类。本试验首先设计了 TAT-caDH融合肽，借助TAT的高效跨膜转导作用，尝试通过取食途径将DH作用于害虫，分析 TAT融合对保持 DH生物活性的作用；然后将 TAT-caDH融合肽在烟草体内表达，分析在烟草中表达的生物活性，完成基于DH构建新型杀虫基因的研究，探讨 TAT-caDH融合基因作为新型抗虫基因应用的可行性。研究得到以下结论：
　　（1）融合多肽 TAT-caDH具有解除棉铃虫蛹滞育的活性；棉铃虫取食后，可以经消化道横向跨膜运输到达虫体其它组织。在适宜棉铃虫幼虫生长的条件下（27℃，光周期：L:D=（14:10）h），以及在诱导滞育的条件下（20℃，光周期：L:D=（10:14）h），融合肽 TAT-caDH饲喂棉铃虫幼虫后，均可以抑制幼虫的生长发育。处理组幼虫取食TAT-caDH后的历期分别为22±2.3d和50±11.4d，显著长于对照组（P<0.01），对照组分别为19±1.3d和38±18.9d；处理组化蛹率分别为76.9±2.2％和64±4.3%，显著低于对照组（ P<0.01），对照组分别83±3.9%和79±2.1%。两种生长条件下的蛹重和诱导滞育条件下的滞育率与对照组之间没有显著性差异。与此同时，取食 caDH的幼虫在幼虫历期、化蛹率、蛹重和诱导滞育条件下的滞育率与对照组间均无显著性差别。
　　（2）通过农杆菌介导的叶盘法对烟草进行了遗传转化。分化培养基采用的是MS基本培养基，添加终浓度0.05mg/L NAA、0.05mg/L6-BA和0.01mg/L TDZ；通过50mg/L的卡纳霉素（km）在分化和生根阶段筛选，获得6棵抗性苗；用特异的引物对抗性苗基因组 DNA进行 PCR分子扩增，挑选出3棵为阳性的转基因烟草；Q-PCR试验结果表明3棵阳性苗在 mRNA表达水平并不一致，之间差别分别是4.1倍、1.9倍和1倍；western蛋白免疫印迹结果证明了3棵阳性苗均正确表达出了TAT-caDH融合蛋白。
　　（3）挑选生长良好的 TAT-caDH转基因株系1和转基因株系2饲喂棉铃虫3龄幼虫。在27℃，光周期：L:D=（14:10）h条件下，幼虫饲喂转基因株系1和转基因株系2叶片，2d后体重分别为45.1±4.0mg和61.5±6.1mg，4d后体重104.8±8.5mg和121.9±13.3mg，显著小于对照组2d和4d的体重（分别为81.1±5.8mg和151.1±9.9mg），TAT-caDH转基因烟草对取食幼虫生长表现出显著的抑制作用；在20℃，光周期：L:D=（10:14）h条件下，棉铃虫幼虫生长缓慢，幼虫饲喂转基因株系1和转基因株系2叶片，12d后体重分别72.9±5.7mg和62.2±8.2mg，16d后分别为104.7±8.9mg和121.9±15.0mg，20d后分别为167.2±15.2mg和171.5±19.2mg，均低于同时期对照组体重（80.5±7.9mg、122.0±8.6mg和191.9±12.9mg），幼虫体重间差异没有在27℃，光周期：L:D=（14:10）h条件下明显。
　　本试验将滞育激素应用于昆虫取食活性研究，并将滞育激素遗传转化烟草进行了表达， TAT-caDH融合肽对取食棉铃虫幼虫生长具有抑制作用，融合基因TAT-caDH为新型抗虫基因的构建提供了新的思路。

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目录

第1章 文献综述

1.1 滞育的意义

1.2 滞育的调控

1.3 滞育激素

1.4 蛋白质转导结构域

1.5 本研究的目的意义

第2章 TAT-caDH融合肽对棉铃虫的活性分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 结论与讨论

第3章 遗传转化烟草及其表达研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 结论与讨论

第4章 转基因烟草对棉铃虫幼虫的生物测定

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 结论与讨论

第5章 结论

5.1 TAT对caDH的生物活性的增效作用

5.2 融合基因TAT-caDH整合入烟草基因组并正确表达

5.3 转TAT-caDH基因烟草抑制棉铃虫幼虫的生长发育

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读学位期间的研究成果