5-HT加重DSS诱导小鼠肠炎并上调小鼠结肠中MMP-3和-9的表达

摘要

背景：5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）是由色氨酸合成的一种单胺神经递质，主要由胃肠道肠嗜铬细胞分泌。5-HT是一种重要的黏膜调控分子，可以调控肠道运动和分泌功能，维持肠道平衡，同时在中枢神经系统中作为神经递质起作用。5-HT通过激活一系列广泛表达于肠道的5-HT受体来发挥作用，参与肠道疾病的发病机制，包括炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）。IBD是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，各种炎症因子，比如细胞因子、生长因子、活性氧、胃肠道激素和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）都参与肠道炎症的发生和发展。MMPs是一组结构相关的Zn和Ca依赖的酶，这些酶可以分解大部分细胞外基质的降解成分，调节细胞因子等炎症因子的活性，调控肠道炎症过程。虽然5-HT和MMPs在IBD的病理发展中都起着重要作用，但是对于在肠道炎症发展过程中5-HT对MMPs的表达调控仍然不清楚。
　　目的：探究5-HT对葡聚糖硫酸钠（dextra sulfate sodium, DSS）诱导肠炎的作用以及对MMPs表达的影响。
　　方法：将63只7-8周龄的健康清洁级 C57BL/6J（B6）雄鼠按照体重随机分为6组：对照组（8只），低剂量5-HT组（9只）、高剂量5-HT组（9只）（分别给予1.0mg/kg和2.0 mg/kg的5-HT灌肠），低剂量DSS组（12只）、高剂量DSS组（9只）（分别饮用1.0％或2.5% DSS溶液），DSS+5-HT组（14只）（给予1.0% DSS和1.0 mg/kg5-HT），于第6天结束时处死小鼠收集标本。通过疾病活动指数评分（disease activity index, DAI）、结肠长度测定和HE染色等方法以及细胞因子白介素（interleukin, IL）-6、IL-8和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α mRNA水平评估肠道炎症程度，采用实时定量PCR技术检测小鼠结肠组织中 MMP-2，-3，-9和基质金属蛋白酶组织抑制因子（ tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP）-1，-2 mRNA水平，采用免疫组织化学法检测小鼠结肠组织中MMP-3和-9蛋白的表达情况。体外培养Caco-2细胞和人白细胞，分别用不同浓度的5-HT刺激细胞，干预6 h和24 h后收集细胞，应用实时定量PCR技术分别检测MMP-3和-9 mRNA的表达量。
　　结果：
　　1.对照组、低剂量5-HT组和高剂量5-HT组小鼠无肠炎，而低剂量DSS组有轻微肠炎、DSS+5-HT组和高剂量 DSS组有严重肠炎。在低剂量 DSS组、DSS+5-HT组和高剂量 DSS组中， DAI评分与对照组相比均显著增高（均P<0.05）；结肠长度均有不同程度的缩短，其中DSS+5-HT组和高剂量DSS组结肠长度缩短严重（均 P<0.05）；结肠内均有不同程度的血便（均 P<0.05）。HE染色评分结果显示对照组、低剂量5-HT组和高剂量5-HT组无炎症，低剂量DSS组呈轻度炎症，DSS+5-HT组和高剂量DSS组炎症程度严重（均P<0.05）。
　　2.高剂量的5-HT增加IL-6和IL-8 mRNA的表达量，但是不增加TNF-α mRNA的表达水平。IL-6和TNF-α mRNA随炎症程度而增加，即与对照组相比，在低剂量DSS组中这两者的基因表达水平增高，DSS+5-HT组和高剂量DSS组中进一步增高（均P<0.05）。
　　3.5-HT增加小鼠结肠组织中MMP-3和-9 mRNA及蛋白的表达：与对照组相比，低剂量5-HT上调MMP-3和-9 mRNA和蛋白的表达，在高剂量5-HT组中MMP-3 mRNA和蛋白表达进一步上调（均P<0.05），而MMP-9不上调。在DSS诱导的小鼠肠炎模型中，MMP-3和-9 mRNA及蛋白随着炎症程度的加重而表达量上调（均P<0.05）。MMP-2、TIMP-1和-2 mRNA不受5-HT的影响，但是随炎症加重其表达量也显著升高（均P<0.05）。
　　4.5-HT增加Caco-2细胞中MMP-3 mRNA和白细胞中MMP-9 mRNA的表达。
　　结论：
　　1.本实验证实了5-HT可以加重DSS诱导的小鼠结肠炎，但是从组织病理学上观察，5-HT单独使用时无肠炎表现。
　　2.5-HT能够诱导小鼠结肠组织和 Caco-2细胞及白细胞中 MMP-3和-9的表达上调，表明由5-HT引起的这些 MMPs的表达的升高参与炎症性肠病的发生发展过程。
　　3. MMP-2、-3和-9及TIMP-1和-2都随炎症的加重而表达增高，表明MMPs和TIMPs家族参与结肠黏膜炎症的病理生理过程。

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第1章 绪论

1.1 研究背景

1.1.1 炎症性肠病的概述

1.1.2 5-羟色胺概述

1.1.3 基质金属蛋白酶概述

1.1.4 5-HT和MMPs与炎症性肠病

1.1.5 5-HT和MMPs与其他疾病

1.2 研究目的

1.3 研究意义

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 动物

2.1.2 细胞

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.1.5 试剂的配置

2.2 实验方法

2.2.1 小鼠分组及模型建立

2.2.2 小鼠组织取材

2.2.3 观察指标

2.2.4 Caco-2细胞培养与处理

2.2.5 细胞实验处理与样本采集

2.2.6 HE染色及组织病理学评分

2.2.7 免疫组织化学染色及结果判定标准

2.2.8 总mRNA的提取与检测

2.3 统计学方法

第3章 实验结果

3.1 一般情况观察及DAI评分

3.2 结肠长度及结肠内血便评分

3.3 组织病理学评分

3.4 结肠组织中的IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的表达

3.4.1 IL-6 mRNA的表达

3.4.2 IL-8 mRNA的表达

3.4.3 TNF-α mRNA的表达

3.5 结肠组织中MMP-2，-3，-9和TIMP-1，-2的表达

3.5.1 5-HT增加小鼠结肠中MMP-3和-9的表达

3.5.2 小鼠结肠中MMP-2，TIMP-1和-2 mRNA的表达

3.6 细胞中MMP-3和-9的表达

3.6.1 5-HT增加Caco-2细胞中MMP-3的表达

3.6.2 5-HT增加白细胞中MMP-9的表达

第4章 讨论

4.1 5-HT加重DSS诱导的小鼠肠炎

4.2 5-HT对MMP家族在小鼠结肠组织中的表达的影响及意义

4.2.1 5-HT诱导MMP-3的表达

4.2.2 5-HT对MMP-9表达的影响及意义

4.2.3 MMP-2与TIMP-1和-2的表达情况

第5章 结论

参考文献

缩略语词汇表

致谢

攻读学位期间的研究成果