二甲双胍与HMS5552联用对2型糖尿病大鼠糖代谢作用机制的研究

摘要

目的：研究二甲双胍与葡萄糖激酶激活剂（glucokinase activators, GKAs） HMS5552联用对2型糖尿病（type 2 Diabetes Mellitus，TD2M）大鼠糖代谢的作用机制。 方法：从 100 只健康雄性 SD 大鼠中随机挑出 8 只作为正常对照组(normal control group, NC)，喂以普通饲料，其余用高脂高糖饲料喂养2个月后采用一次性腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）40mg/kg 的方法诱导建立 2型糖尿病大鼠模型，连续两次空腹血糖（fasting plasma glucose ，FPG）≥8.0mmol/L的即为2型糖尿病大鼠模型。建模成功后，禁食12小时，麻醉大鼠，心脏取血，离心取上清，测 FPG、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、胰岛素（insulin，INS）和胰高血糖素(glucagon, GC)含量。将建模成功的大鼠随机分为七组，每组 8 只 1.糖尿病组(diabetes group, DM)2.HMS5552 低剂量治疗组(HMS-L, 10 mg/kgHMS5552)3. HMS5552 高剂量治疗组(HMS-H, 30 mg/kg HMS5552)4.二甲双胍低剂量治疗组(MET-L, 80 mg/kg 二甲双胍)5. 二甲双胍高剂量治疗组(MET-H, 240 mg/kg二甲双胍)6. HMS5552低剂量+二甲双胍低剂量治疗组(HMS-L+MET-L, 10 mg/kg HMS5552+80 mg/kg二甲双胍)7. HMS5552低剂量+二甲双胍高剂量治疗组(HMS-L+MET-H, 10 mg/kgHMS5552+240 mg/kg二甲双胍)。分组后，尾静脉采血做口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）和口服药物耐量试验(oral drug tolerance test, ODTT)。每天对各组进行相应药物灌胃， NC组和DM组用等体积生理盐水灌胃。药物治疗期间，观察大鼠的一般情况，每周测体重。药物治疗4周，禁食12小时后，尾静脉采血做OGTT、ODTT实验，处死大鼠，心脏取血，离心取上清，测FPG、TG、 TC、INS和GC含量。采用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法检测肝脏组织中葡萄糖激酶（ glucokinase, GK）的酶活性；采用RT-PCR法检测GK的表达变化；取肝脏、胰腺组织HE染色观察病理学变化，免疫组织化学染色观察肝脏中GK、胰腺中INS和GC的表达；采用western-blot法检测肝脏组织GK、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（P-ACC）在蛋白水平的表达情况。 结果：（1）成功建立2型糖尿病大鼠模型，FPG＞8.0mmol/L。 （2）体重方面，未注射STZ前，高脂高糖饲料喂养的大鼠体重增长速度高于正常组。第14周，与DM组比较，HMS-H组，MET-H组差异有统计学意义（P＜0.05），HMS-L+MET-L组，HMS-L+MET-H组差异显著（P＜0.01）。 （3）OGTT结果显示，治疗后，与DM组相比，所有治疗组的△AUC0-240均有所下降（P＜0.01）。且HMS-H组，MET-H组，HMS-L+MET-L组和HMS-L+MET-H组的葡萄糖达峰时间较用药前提前30min。 （4）ODTT结果显示，治疗后，各治疗组的初始血糖较治疗前有了不同程度的下降，餐后60min最大血糖值较治疗前下降明显；与DM组相比，HMS-H组、HMS-L+MET-H组差异有统计学意义（P＜0.05）。 （5）血清学指标显示，治疗后，高脂高糖喂养的大鼠胆固醇（TC）水平较治疗前有所升高，但各治疗组的TC水平低于同时期的DM组。 治疗后，各组大鼠的甘油三酯（TG）水平较治疗前有所升高，但各治疗组的TG水平低于同时期的DM组。 治疗前，高脂高糖喂养的大鼠空腹血糖（FPG）明显高于NC组，显示造模成功。治疗后，与DM组相比， HMS-L组差异有统计学意义（P＜0.05），其余治疗组的下降幅度较大（P＜0.01）。 治疗后，与DM组相比， MET-H组血清胰岛素（INS）水平升高明显（P＜0.01）。 治疗后，各组大鼠的血清胰高血糖素（GC）水平较治疗前有所下降。与DM组相比， 各治疗组差异无统计学意义（P＞0.05）。 （6）GK酶活性结果显示，治疗后，与DM组相比，MET-L组、MET-H组差异有统计学意义（P＜0.05），其余各治疗组差异明显（P＜0.01）。 （7）GKmRNA结果显示，治疗后，与DM组比，各治疗组的表达量显著增加（P＜0.01）。 （8）肝脏HE染色结果显示， NC组大鼠肝脏中肝细胞结构完整，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，肝小叶及细胞核结构正常。DM组大鼠肝细胞出现了脂肪样变，肝细胞核发生了核溶解，肝索排列紊乱。各治疗组都有了不同程度的改善。 胰腺 HE 染色结果显示， NC 组大鼠胰腺组织结构形态完整，胰岛细胞清晰可见，胰岛内部的细胞呈团索状整齐排列。DM组大鼠胰岛内细胞有所减少并出现萎缩。各治疗组胰岛内细胞较DM组有所增加，萎缩程度也有所减轻。 （9）免疫组化染色结果显示，与DM组相比，HMS-L组的GK表达量有所升高（P＜0.05），HMS-H组、HMS-L+MET-L组和HMS-L+MET-H组明显升高（P＜0.01）。 胰岛素（INS）染色结果显示，与DM组相比，HMS-H组、MET-L组的INS表达量有所升高（P＜0.05），MET-H组、HMS-L+MET-L组和HMS-L+MET-H组升高明显（P＜0.01）。 胰高血糖素（GC）染色结果显示，与DM组相比，MET-L组的GC表达量有所下降（P＜0.05），其余各治疗组明显下降（P＜0.01）。 （10）免疫印迹结果显示，GK的蛋白表达，除MET-L和MET-H组外其余各治疗组与DM组相比，GK的表达量都升高明显（P＜0.01）。 AMPK免疫印迹结果显示，与DM组相比，各治疗组AMPK的表达量显著升高（P＜0.01）。 P-ACC/ACC 免疫印迹结果显示，与 DM 组相比，HMS-L组表达量的差异无统计学意义（P＞0.05），HMS-H 组表达量有差异性（P＜0.05），其余四组差异显著（P＜0.01）。 结论：（1）降低血糖方面，联合用药优于单独用药。 （2） 提升胰岛素及降低胰高血糖素方面，联合用药优于单独用药。 （3）HMS5552可以升高GK的浓度及活性，二甲双胍可以升高GK的浓度，联合用药优于单独用药。 （4）HMS5552可能通过AMPK-ACC信号通路降低血糖。

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