生姜总姜酚和总黄酮的制备及对PC12细胞拟脑缺血模型的保护作用研究

摘要

目的：提取分离生姜总姜酚、总黄酮，并对其进行含量测定以及PC12细胞的损伤抑制研究，为生姜抗脑缺血有效部位的深入研究奠定基础。
　　 方法：
　　 1.采用75％乙醇，按1∶3(m∶v)比例对生姜中的主要成分进行提取。提取物以甲醇溶解除杂，浓缩甲醇溶出物得浸膏。以聚酰胺为柱层析材料，以不同浓度乙醇-水溶液为洗脱剂，对生姜浸膏进行分离。采用硅胶G板，以石油醚-乙酸乙酯(7∶3)为展开剂，5％盐酸酸性三氯化铁乙醇溶液和三氯化铝乙醇溶液为显色剂进行薄层(TLC)检测，50％乙醇洗脱部分为姜酚类化合物，减压蒸干得总姜酚干膏；95％乙醇洗脱部分减压蒸干得总黄酮干膏，并用紫外分光光度法对生姜总黄酮进行含量测定。
　　 以石油醚-乙酸乙酯(7∶3)为洗脱剂，以硅胶为柱层析填料对总姜酚进行粗分；以6-姜酚、8-姜酚为对照品，分别吸取洗脱液5-10μl，点于硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯(7∶3)、氯仿-甲醇(9∶0.5)为展开剂，5％盐酸酸性三氯化铁乙醇溶液显色；根据TLC检测结果合并洗脱液，浓缩蒸干。
　　 采用制备型高效液相(Prep-HPLC)，色谱条件：C18ODBTM10um色谱柱(30mm×150mm)；流量15ml/min；检测波长：280nm、370nm；进样量3-5ml；流动相：甲醇-水(65∶35)，对总黄酮进行分离纯化得到单体化合物。
　　 2.采用H2O2造成PC12细胞损伤模型，通过倒置显微镜观察细胞的形态，MTT法测定了解PC12细胞损伤情况和存活率，研究6-姜酚、8-姜酚、总姜酚、总黄酮和对照品的细胞保护作用；
　　 结果：
　　 1.共提取生姜27.06 kg，得生姜75％乙醇提取物干膏0.8kg，提取率为2.96％。取500g生姜75％乙醇提取物，分离得到总姜酚126.0g，得率为25.2％。从总姜酚分离出6-姜酚，8-姜酚两个单体化合物。
　　 以芦丁为对照品，测得生姜总黄酮提取物中黄酮类化合物含量为12.86％，加样回收实验RSD值为1.86％。分离得生姜黄酮I(929.5mg)，化合物2(40.6mg)。以生姜黄酮I为对照品，以高效液相色谱法测得生姜总黄酮中黄酮I的含量为0.79％。
　　 2.与损伤组比较，6-姜酚1μM、10μM；总姜酚10μM；总黄酮(0.01-0.5μg/L)可明显提高A570OD值，显著提高PC12细胞生存率(P＜0.05 or P＜0.01)。8-姜酚的A570OD值与损伤组比较无显著差异，无统计学意义。
　　 结论：
　　 1.以该提取方法提取生姜总姜酚和总黄酮，操作简便,结果准确可靠，为进一步研究生姜中总姜酚和总黄酮的提取工艺提供理论依据。
　　 2.6-姜酚1μM、10μM，总姜酚10μM和总黄酮(0.01-0.5μg/L)对H2O2损伤的PC12细胞具有明显的保护作用。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分 生姜总酚酸和总黄酮的制备及含量测定

1生姜总酚酸与总黄酮的制备

1.1材料

1.2方法

1.3结果

2总姜酚酸与总黄酮中单体化合物的分离与检测

2.1材料

2.2方法

2.3结果

3.总黄酮的含量测定

3.1材料

3.2紫外分光光度法测定生姜总黄酮的含量

3.3结果

3.4高效液相色谱法测定生姜总黄酮中黄酮Ⅰ的含量

3.5结果

4讨论

第二部分：生姜姜酚、总黄酮对PC12细胞拟缺血损伤保护作用的研究

1材料

1.1药品与试剂

1.2 PCI2细胞株：

1.3主要仪器

2方法

2.1溶液与试剂

2.2细胞培养

2.3造模及给药

2.4统计学方法处理

3 H2O2氧化损伤模型

4 MTT比色法

5实验结果

5.1生姜姜酚[45-49]对H2O2致细胞损伤的保护作用

6数据统计

7细胞形态学观察

8讨论

结论

参考文献

附录 综述：生姜总黄酮的研究概况

致谢