变形斑沙雷氏菌336X生防相关基因phy的克隆、功能分析及原核表达

摘要

变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)336X菌株能抑制由子囊菌禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var．tritici，Ggt)侵染根部所引起的小麦全蚀病(take—allof wheat)，具有开发成生防制剂的潜力。从分子水平上探索336X的生防机制，研究生防细菌与植物之间的相互作用，具有重要的理论和现实意义。
　　 在本研究中，用变形斑沙雷氏菌568菌株基因组中一个预测的ABC转运系统相关基因设计引物phyF/R，以336X基因组DNA作为模板，通过PCR扩增出全长1569bp的完整ORF片段。扩增片段用载体pMD—18T克隆，经过测序分析，发现该片段和568菌株预测的4’—phytase同源，同源性指数为94％，故将该基因命名为phy。保守域序列分析表明，预测氨基酸序列和周质可溶性结合蛋白家族Ⅱ(PBP2_NikA_DppA_OppA_like_7)同源，相似性达15—21％。通过信号肽预测程序SignalP3．0 Server分析，发现在N端有一段31个氨基酸的信号肽序列，成熟肽链可能在27—28位氨基酸处切开。
　　 为了研究phy的功能，将phy片段插入自杀性载体pKAS32，并用卡那霉素抗性片段中断，构建同源双交换敲除载体pKAS2—phy—km。通过接合作用将该质粒从大肠杆菌(Escherichia coli，E．coli)S17—1导入336X中，PCR检测得到3株phy缺陷型突变株。通过一系列的表型实验，发现突变株摄取Ni2+的能力下降，表明phy可能编码Ni2+运输过程中的Ni2+结合蛋白组分。同时发现突变株的生防能力下降，对小麦根部分泌物的应答减弱，在小麦根表的定殖数量减少。这些结果可能有助于我们分析336X的生防机制。
　　 为了进一步研究phy性质，将phy的ORF序列插入pET—30a中构建异源表达载体pET30a—phy，将该载体导入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。结果发现经过异丙基—β—D—硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，一个约60 kD的重组蛋白得以表达。对诱导条件进行了优化，发现最适的条件为：0．5 mmol/L IPTG于28℃下诱导5 h。表达的包涵体蛋白通过超声破碎、6 mol/L盐酸胍溶解后，变性条件下用Ni2+—NTA亲和柱纯化，及梯度复性得到可溶性蛋白。本研究为蛋白的序列分析，结构鉴定及活性部位研究等奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

1.前言

1.1 小麦全蚀病

1.1.1 小麦全蚀病及防治现状

1.1.2 生物防治在控制小麦全蚀病中的应用

1.1.3 微生物生物防治中的作用机制

1.2 细菌趋化性与生物防治

1.2.1 细菌趋化性

1.2.2 趋化性与植物生物防治的研究

1.2.3 趋化性的作用机制

1.3 变形斑沙雷氏菌

1.2.1 沙雷氏菌属及生防相关研究

1.2.2 变形斑沙雷氏菌可能的生防机制

1.2.3 变形沙雷氏菌与植物根的相互作用

1.4 立题背景和意义

2 材料与方法

2.1 供试材料

2.1.1 细菌与质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 试剂

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的培养

2.2.2 基本操作技术

2.2.3 phy基因克隆与测序

2.2.4 序列分析

2.2.5 336X中phy基因的定点敲除

2.2.6 phy基因的功能分析

2.2.7 phy基因的原核表达

3 结果与分析

3.1 基因的克隆与测序

3.1.1 336X基因组DNA的提取

3.1.2 phy基因的扩增

3.1.3 基因克隆与测序

3.2 预测氨基酸序列分析

3.3 基因敲除载体的构建及336X菌株phy基因的敲除

3.3.1 敲除载体的构建

3.3.2 336X中phy基因的定点敲除

3.4 phy基因功能的测定

3.4.1 野生型菌株产植酸酶的测定

3.4.2 突变株对寡肽的利用差异

3.4.3 突变株的脲酶活性变化

3.4.4 突变株对小麦全蚀病的生防能力差异

3.4.5 突变株在小麦根际定殖能力的差异

3.4.6 突变株对小麦根际分泌物的趋向性差异

3.5 重组蛋白的原核表达

3.5.1 重组原核表达载体的构建

3.5.2 重组蛋白的原核表达

3.5.3 诱导表达蛋白的纯化和复性

4 结论

5 讨论

5.1 phy基因的功能分析

5.2 336X菌株的生防机制分析

5.3 重组蛋白的原核表达

6 展望

参考文献

致谢