中国粗山羊草中新型puroindoline基因的克隆及分析

摘要

籽粒硬度是小麦重要的品质性状之一，Puroindoline a(Pina)和Puroindoline b(pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因。两者之中任何一个个发生突变或者缺失都会对籽粒硬度造成不同的影响。本研究就是针对本实验室系统收集并分类的新疆及黄河流域的51份中国粗山羊草材料，利用SDS—PAGE和特异引物PCR的方法对其Puroindoline蛋白和基因进行分析，主要研究内容及结果如下：
　　 (1)Puroindoline蛋白电泳分析：从选取的51份粗山羊草材料成熟的种子中提取Puroindoline蛋白，利用SDS—PAGE进行电泳分离。发现51份材料puroindoline蛋白的分子量均约为15kD左右。
　　 (2)Puroindoline新型等位基因的克隆分析：利用Genebank中已知的Pina和Pinb基因序列设计引物，以51份材料的DNA为模板，在优化的PCR体系下进行扩增，成功克隆测序了32个Pina和35个Pinb基因，序列分析结果表明其中30个Pina，32个Pinb测序序列和GenBank已有序列完全相同，但材料来源不同。2个序列确定为Pina的新型等位基因；3个确定为Pinb新型等位基因。它们的序列全长均为447bp，编码148个氨基酸残基，具有麦类作物：PinA、PinB蛋白所特有的WRWWKWWK和WPTKWWK色氨酸结构域。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写符号及中英文对照表

前言

1.1 小麦籽粒硬度概述

1.2 小麦籽粒硬度形成的基础

1.3 籽粒硬度测试方法

1.4 小麦籽粒硬度生化研究

1.4.1 Friabilin蛋白

1.4.2 Puroindoline蛋白

1.5 籽粒硬度突变类型

1.6 籽粒硬度与小麦品质的关系

1.7 Pina和Pinb基因在其它物种的分布

1.8 粗山羊草中的Puroindoline研究

1.9 本研究的目的和意义

2 Puroindoline蛋白分析

2.1 材料和试剂

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要试剂及配制

2.1.3 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 Puroindolines蛋白提取方法

2.2.2 蛋白质的电泳方法

2.2.3 染色方法

2.2.4 干胶制备

2.3 结果与分析

2.4 讨论

3 Puroindoline基因的克隆及分析

3.1 材料和试剂

3.1.1 实验材料

3.1.2 菌株

3.1.3 主要试剂及配制

3.1.4 主要仪器设备

3.2 方法

3.2.1 CTAB法提取基因组DNA

3.2.2 Puroindoline基因PCR扩增

3.2.3 PCR产物回收、纯化

3.2.4 目的片段的T载体连接

3.2.5 感受态细胞的制备

3.2.6 转化大肠杆菌DH5α

3.2.7 阳性克隆筛选

3.2.8 Pina、Pinb序列测定及分析

3.3 结果与分析

3.3.1 基因组DNA提取

3.3.2 PCR扩增结果

3.3.3 目的片段克隆和测序

3.3.4 Puroindoline新型等位基因及推导的氨基酸序列

3.3.5 Puroindoline新型等位基因的蛋白结构预测

3.3.6 Puroindoline等位基因分布

3.3.7 粗山羊草中Puroindoline等位基因的进化关系

3.4 讨论

4 结论

参考文献

致谢