利用BiFC技术研究拟南芥GPX3和RRTF1与DOS1体内相互作用

摘要

逆境胁迫可以分为非生物胁迫与生物胁迫两大类，严重影响着植物的正常生长发育，其中许多非生物胁迫都可以诱导植物体内产生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)，因此ROS可能是各种胁迫信号的交叉点。近年来，科学家们通过DNA微阵列技术分析了植物体内大量受ROS调控的基因，对这些基因的功能进行了研究，并得到了许多在ROS信号转导中起重要作用的基因元件。
　　 实验室前期的研究发现，拟南芥GPX家族中的GPX3(Glutathione peroxidase 3)编码一个双功能蛋白，不仅能够清除植株体内过量的H2O2，而且可以直接或间接调节上游氧化信号，传递和激活下游信号分子；AtDOS1(Drought overly sensitive 1)则是通过酵母双杂交实验证实的能与GPX3发生强烈体外互作的蛋白因子，DOS1定位于细胞核中，具有核定位信号(NLS)和保守序列WWE domain(Trp-Trp-Glu)，在植物应答干旱和氧化胁迫中发挥重要作用。进一步的研究表明，DOS1可能为植物氧化胁迫信号转导途径中一个重要的转录调节因子，并且在H2O2胁迫下，DOS1会从细胞核向细胞质跨膜扩散，从而参与胁迫信号的传递。AtRRTF1(ROS related transcription factor 1)则是另一个通过芯片分析得到的可能与AtDOS1存在相互作用的基因，该基因编码带有锌指结构的转录因子，其表达受H2O2诱导，在生物及非生物胁迫信号转导中起中心作用。酵母双杂交实验也显示RRTF1和DOS1之间存在体外相互作用。但目前我们仍然缺少GPX3与DOS1以及RRTF1与DOS1之间存在体内互作的证据，并且对于DOS1在氧化胁迫下的跨膜运动及机理也不甚明了。
　　 本论文通过双分子荧光互补实验(BiFC)研究了GPX3与DOS1之间以及RRTF1与DOS1之间的体内互作关系，发现在野生型拟南芥叶肉细胞原生质体内，均能检测到这两对蛋白之间发生相互作用的黄色荧光信号，说明GPX3与DOS1以及 RRTF1与DOS1都存在体内互作。进一步的DAPI染色实验证明DOS1与RRTF1发生互作的部位在细胞核内。在gpx3突变体原生质体中，没有检测到较为明显的RRTF1与DOS1之间互作的荧光，表明GPX3可能影响DOS1与RRTF1之间的相互作用。为确定GPX3与DOS1以及RRTF1与DOS1之间的体内互作是否影响氧化胁迫下DOS1的跨膜运动，从而影响DOS1传递胁迫信号，我们将实验室已有的DOS1::GFP转化WT植株(WT-DOS1::GFP)分别和gpx3，rrtf1 T-DNA插入纯合突变体进行杂交，筛选出带有DOS1-GFP标签的gpx3和rrtf1突变体植株(gpx3-DOS1::GFP和rrtf1-DOS1::GFP)，用激光共聚焦扫描电子显微镜分别观察氧化胁迫下两种突变体中DOS1的跨膜运动与WT中的差异，经过统计分析发现GPX3对DOS1的抗氧化胁迫运动有一定影响，在缺失GPX3的情况下，更有利于拟南芥下表皮条保卫细胞中的DOS1在受到H2O2和ABA作用时发生从细胞核向细胞质扩散的现象；而RRTF1表达下调时，DOS1的跨膜运动与正常情况相比没有明显的差别，说明RRTF1可能与DOS1的扩散关系不大。
　　 综上所述，GPX3与DOS1以及RRTF1与DOS1之间均存在体内互作，并且GPX3在一定程度上影响DOS1与RRTF1的体内相互作用；同时，GPX3与DOS1之间的体内互作可能影响DOS1在氧化胁迫下的运动。

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