陆地棉低酚种子干涉载体的构建与应用

摘要

棉花不仅是一种重要的纤维资源,同时也是一种重要的油料和蛋白质资源。但是,由于棉酚等有毒物质的存在,大大限制了棉籽产品的利用。由于完全没有棉酚的棉花品种极易受到病虫害侵袭,因此,为了能够充分利用棉酚的抗生性,避免棉酚对人畜的毒害,培育植株高棉酚、种子低棉酚的棉花新品种成为了目前育种工作的重点。传统的杂交育种手段周期长、性状不易发现,很难快速的培育出新品种。植物基因工程技术在育种中的应用大大缩短了育种周期,提高了育种速度,越来越受到重视。RNAi是一种转录后基因沉默现象,作为一种高效的基因敲除技术,在棉花的遗传改良、抵御抗病虫害等方面具有广阔的应用前景。RNAi在植物上应用常需要构建能表达双链RNA的干涉载体,通过遗传转化到植物体中引发RNAi。
　　本研究采用基因工程技术,以棉酚合成途径中的关键酶杜松烯合成酶(CAD)、(+)-δ-杜松烯8位羟化酶(CYP706B1)的基因作为靶标,利用种子特异性启动子构建了适用于棉花转化的RNAi载体。并通过农杆菌侵染法转化棉花,旨在获得种子低酚、植株高酚的棉花新材料。为在棉花上利用干涉技术进行遗传改良研究提供良好的基础。主要结果如下:
　　利用表达谱分析获得了拟南芥胚胎发育后期特异基因AT3G27660,利用PCR扩增,从拟南芥中克隆了该基因上游约2000bp的调控序列,并成功构建了由AT3G27660驱动报告基因GUS的植物表达载体pCOASP3。采用农杆菌介导转化拟南芥,对T0代种子进行筛选,获得的转基因植株。结果表明,该启动子在种子中随着胚胎发育活性逐渐增强,胚胎后期活性最高,在叶、根、茎等部位几乎不表达。说明该启动子是比较特异的种子特异性启动子,在正常情况下不会引起功能基因在其他组织部位的特异表达。可以作为种子特异性启动子用于品种改良。
　　根据已经发表的棉花种子特异性启动子α-globulin B gene启动子序列,从陆地棉中PCR扩增出该启动子,并构建TEGP载体。作为构建特异性启动子启动的RNAi载体的启动子。
　　利用已公布的棉酚代谢中的关键酶基因杜松烯合成酶基因的八个同源基因和(+)-δ-杜松烯8位羟化酶基因序列,序列比对获得干涉片段区,设计引物,PCR获得正反向干涉片段;利用棉花种子特异性启动子α-globulin B gene启动子(GP)和拟南芥种子特异性启动(ASP3)与正向干涉片段连接构建中间载体TEGPSCD、TEGPSY、TMA3SY;利用 pHANNBA载体上的intron区与反向干涉片段连接构成中间载体 pHGAY和pHGACD;以表达载体pCIMBLA2301为骨架,构建分别由种子特异性启动子GP和ASP3启动的靶向基因CYP706B1的RNAi载体:pCGSIAY、pCA3SIAY以及由GP启动的靶向基因CAD的RNAi载体:pCGSIACD。将pGSIAY质粒载体转化农杆菌后,利用农杆菌介导的遗传转化法转化棉花,诱导分化出胚性愈伤组织。下一步工作将诱导成苗。

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1前 言

1.1棉酚色素腺体的研究

1.2 棉酚的研究

1.3 棉酚合成途径的研究

1.4棉酚合成途径的关键酶

1.5 低酚棉育种的研究

1.6棉花遗传转化方法

1.7 植物启动子的研究

1.8基因沉默技术的研究

1.9研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2拟南芥种子特异性启动子的克隆与功能验证

2.3 棉花的球蛋白启动子的获得

2.4 干涉中间载体构建

2.5干涉表达载体的构建

2.6 RNA干涉载体的遗传转化

3结果分析

3.1拟南芥种子特异性启动子的克隆与功能验证

3.2 棉花启动子克隆

3.3 RNA干涉载体的构建

3.4棉花的遗传转化

4讨论

4.1 低酚棉育种方法

4.2 种子特异性启动子的克隆和分析

4.3 RNA干涉载体的构建

5结论

参考文献

致谢