佛波酯联合粒细胞集落刺激因子对人骨髓造血作用的实验研究

摘要

研究背景：
　　骨髓抑制是肿瘤病人化、放疗后常见的毒副作用，轻度骨髓抑制在应用G-CSF、EPO、TPO等药物后多可快速恢复，但是高剂量的放、化疗或长期的化疗常可导致严重的骨髓抑制，重度的骨髓抑制增加了患者感染、出血的风险，严重者甚至危及生命。此时仅应用G-CSF、EPO并不能在短期内有效的恢复造血。化疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时，对骨髓中的造血各阶段细胞和骨髓微环境都有损害，然而目前常用的升血药物则主要作用于下游阶段的造血前体细胞。如G-CSF就是作用于骨髓粒系造血祖细胞阶段，然后刺激其增殖，向下游分化，并促进成熟的中性粒细胞释放到循环中;EPO作用于红系造血祖细胞阶段，刺激红系造血，增加外周血中红细胞数量，并且两者对骨髓的造血微环境均无特别的影响。因此在重度骨髓抑制时期，寻找一种能够快速有效的促进骨髓造血的方法很有必要。研究发现12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，简称佛波酯(TPA)，不仅可以诱导多种白血病细胞向正常细胞分化，而且发现它有促进造血的作用。
　　目的：
　　体外观察TPA单用或联合G-CSF对AML患者化疗后骨髓抑制时期的骨髓造血细胞和基质细胞的影响。
　　方法：
　　1、利用甲基纤维素半固体培养的方法体外培养来自AML患者化疗后处于骨髓抑制期的骨髓细胞，同一批实验样本来自同一位患者的同一个骨髓样本。分组:空白对照组，TPA单用组（终浓度10 ng/ml），G-CSF单用组（终浓度50ng/ml），TPA与G-CSF联合组（终浓度分别为10 ng/ml+50ng/ml），不同组别的药物分别加入到不含任何刺激因子的不完全培养基中和含EPO、白细胞条件培养液的完全培养基中观察CFU-GEMM、CFU-GM、BFU-E、CFU-E等集落的形成情况。实验重复4次。
　　2、不完全甲基纤维半固体培养基中分别加入不同浓度的TPA，终浓度范围0.1～30ng/ml，并设置空白对照，观察CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E、CFU-E集落的形成情况。
　　3、不完全甲基纤维半固体培养基中分别加入不同浓度的TPA并联合G-CSF（50ng/ml），TPA的终浓度范围为0.1～30 ng/ml，并设置空白对照，观察CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E、CFU-E集落的形成情况。
　　4、体外分别培养健康人基质细胞和AML患者化疗后骨髓抑制期抽取的骨髓获得的基质细胞，给予不同浓度的TPA，终浓度分别为0.1ng/ml、1.0 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml，设置对照。用CCK8法检测细胞的增殖或抑制情况。
　　结果：
　　1、不完全培养基中的四组形成集落比较，对照组在培养24-72小时可见到小细胞团，但是随着时间延长细胞均死亡，培养14天计数，对照组无集落形成，TPA单用或联合均能刺激CFU-GM，CFU-GEMM和BFU-E形成，主要是粒单系集落的形成;G-CSF单用只能形成CFU-GM，对红系和早期的混合系集落形成无影响;TPA和G-CSF可以协同促进CFU-GM集落的形成(P＜0.05)，但是两者联合对CFU-GEMM和BFU-E集落的形成无促进作用（P均＞0.05）。
　　2、不完全培养基中的不同浓度TPA刺激后形成集落比较，0.1～30ng/ml浓度范围内可以见到CFU-GM集落的形成，1～20ng/ml浓度范围内可以见到早期混合系集落CFU-GEMM的形成，5～20ng/ml浓度范围内可以见到BFU-E集落形成。单用TPA时最佳的刺激CFU-GM和CFU-GEMM集落形成的终浓度均是5～10ng/ml，比较均有统计学意义(P＜0.05)，而较小终浓度或加大终浓度均不能提高集落的形成。单用TPA最佳的刺激BFU-E集落形成的终浓度是10ng/ml时，该浓度组形成的集落产率最高(P均＜0.05)。
　　3、不完全培养基中的不同浓度TPA联合G-CSF（终浓度50ng/ml）刺激后形成集落比较，形成的主要是髓系集落CFU-GM，也有少量的混合系集落CFU-GEMM，TPA终浓度为1ng/ml～20 ng/ml的联合组中尚可以观察后少量的BFU-E。TPA和50ng/mlG-CSF联合时最佳的刺激CFU-GM形成的终浓度是1ng/ml～5ng/ml(P均＜0.05)。TPA终浓度为5ng/ml的联合组中的CFU-GEMM集落产率最高，5～20ng/ml的终浓度组中的BFU-E集落产率较高。
　　4、完全培养基中的四组祖细胞培养结果，四组中均可以看到CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E和CFU-E集落形成。四组CFU-GM产率比较，联合组的CFU-GM集落产率最多(P＜0.05)，四组CFU-GEMM产率比较，TPA组和联合组均较对照组和 G-CSF组的CFU-GEMM集落产率高（P均＜0.05），但是TPA组和联合组的集落产率比较无统计学意义(P=0.98);联合组和TPA组的BFU-E比较无差别(P=0.38);四组的CFU-E产率比较无统计学意义(P=0.34)。
　　5、TPA在终浓度为5-20ng/ml对于健康人的基质细胞（细胞个数2×105个/ml）表现为促进增殖的作用，小于或大于这个浓度范围均对骨髓基质细胞表现为抑制作用，5ng/ml是最佳的促进增殖浓度。TPA在浓度为5～30ng/ml的浓度范围内均可以促进AML骨髓抑制期患者的骨髓基质细胞（细胞个数2×105个/ml）的生长，10ng/ml是最佳的促进增殖浓度。而G-CSF对健康或AML患者的骨髓基质细胞的增长无影响。
　　结论：
　　1、TPA体外单独用药可以促进人CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E的形成，主要是CFU-GM，最佳的作用终浓度为5～10ng/ml。
　　2、TPA可以协同G-CSF促进人CFU-GM集落的生成，和G-CSF50ng/ml联合时TPA最佳的作用终浓度为1～5ng/ml。TPA和G-CSF联合对CFU-GEMM和BFU-E集落的形成无协同作用。
　　3、G-CSF体外单独用药可以促进人CFU-GM的形成，但是对CFU-GEMM、BFU-E的形成无影响。
　　4、TPA体外单独用药可以促进健康人和AML患者骨髓基质细胞的生长，5ng/ml和10ng/ml分别是最佳的促进增殖浓度。

目录

声明

摘要

1 引言

2．实验材料

2．1 主要试剂

2．2 主要仪器

2．3 试剂的配制方法

2．3．1 2×1640液

2．3．2 2％甲基纤维素半固体培养基

2．3．3 药品配置

2．4 技术路线

3．试验方法

3．1 标本采集

3．2 骨髓单个核细胞的制备

3．3 有核细胞的计数

3．4 不完全培养基的造血干祖细胞集落培养

3．5 分组

3．6 完全培养基的造血干祖细胞集落培养

3．7 集落鉴定

3．8 骨髓基质细胞的培养

3．9 基质细胞的消化、传代

3．10 基质细胞鉴定

3．11 CCK8实验

3．12 统计学分析

4．结果

4．1 不完全培养基中不同分组的集落形成情况

4．2 不完全培养基中加入不同浓度的TPA后集落形成情况

4．3 不完全培养基中加入不同浓度的TPA联合G-CSF(50ng／ml)集落形成的情况

4．4 标准培养基中不同分组的药物加入后集落形成情况

4．5 正常和疾病患者的骨髓基质细胞形态、活力、ALP阳性数

4．6 CCK8法测定TPA、G-CSF对正常、疾病患者的骨髓基质细胞的增殖、抑制情况

5．讨论

6．小结

参考文献

综述 人骨髓造血调控研究

附录A 中英文词缩词表

附录B 主要镜下图片

附录C 攻读学位期间发表的学术论文

致谢