QAMS法测定穿心莲中二萜内酯含量及成分配伍对其抗肿瘤活性的影响

摘要

目的:
　　建立同时测定穿心莲提取物中多种二萜内酯含量的一测多评方法;建立测定穿心莲提取物中总黄酮含量的方法。穿心莲有效部位及有效部位中有效成分配伍对抗肿瘤活性的影响，发现穿心莲中抗肿瘤有效成分和最优成分配伍。
　　方法:
　　以DDA为指标，HPLC法同时测定穿心莲提取物中A、GDA、DOA、NA和DA含量的基础上，测定与其他五种成分的相对校正因子(RCF)，使用RCF计算各成分含量，并比较计算值与标准曲线法和外标法的实测值之间的差异，探究不同品牌色谱柱和仪器对RCF的影响及保留时间差和相对保留时间进行色谱峰定位的准确性，以验证方法的可行性和准确性;以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH-黄酮为显色体系，紫外分光光度法测定穿心莲提取物中总黄酮含量。采用MTT法用4T-1和LLC肿瘤细胞株测试穿心莲乙醇提取物和有效部位的体外抗肿瘤活性，发现抗肿瘤有效成分群;采用组分剔除法研究穿心莲有效部位体外抑瘤起作用的有效成分;运用单形格子实验，观察不同组合对其IC50值的影响，进行有效成分的配伍优化。
　　结果:
　　1、穿心莲中DDA与A、GDA、DOA、NA和DA的RCF重现性良好(RSD＜5％)，RCF值分别为1.348、0.297、0.318、1.133、1.744。利用内标物的保留时间，结合相对保留时间与峰形，即可准确判断目标成分的峰位。六批穿心莲乙醇提取物中六种成分的计算值和实测值没有显著性差异(p=95％，n=6)。穿心莲药材中A、GDA、DOA、NA、DA和DDA的含量分别为2.15％、0.21％、0.32％、0.72％、0.26％和0.77％;穿心莲乙醇提取物中A、GDA、DOA、NA、DA和DDA的含量分别为5.81％、0.85％、0.86％、2.91％、1.46％和2.92％;穿心莲有效部位中A、NA、DA和DDA的含量分别为45.38％、3.62％、8.08％和16.66％。
　　2、UV测定穿心莲总黄酮含量，其线性方程为A=10.9110 C+0.0064，相关系数r=0.9995，线性范围:17.00-82.10μg/mL，总黄酮平均回收率为101.14％，RSD为3.16％。穿心莲药材、乙醇提取物和有效部位中总黄酮类含量分别为1.32％，15.05％和1.55％。
　　3、穿心莲有效部位对4T-1和LLC细胞增殖IC50分别为26.91±3.33μg/mL，44.16±4.28μg/mL;穿心莲乙醇提取物对4T-1和LLC细胞增殖IC50均大于100μg/mL。体外抗4T-1细胞增殖的组分剔除法研究结果显示，穿心莲有效部位、全方配伍和A组的IC50分别为26.91±3.33μg/mL、46.64±6.24μg/mL和29.38±3.65μg/mL，配伍Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的IC50分别为52.66±5.90μg/mL、43.22±2.52μg/mL和49.84±4.88μg/mL。体外抗LLC细胞增殖的组分剔除法研究结果显示，穿心莲有效部位、全方配伍和A组的IC50分别为44.16±4.28μg/mL、51.46±5.21μg/mL和40.80±1.00μg/mL，配伍Ⅱ和Ⅲ组的IC50分别为50.59±1.26μg/mL和63.64±2.46μg/mL。单形格子实验获得体外抗LLC细胞增殖的最优处方:A和DDA(12∶1)配伍的IC50为32.69±2.07。
　　结论:
　　一测多评同时测定A、GDA、DOA、NA、DA和DDA六种二萜类成分，方法稳定可靠，结果准确可信，可用于穿心莲提取物的质量控制;拟建立的总黄酮测定方法稳定可靠、重现性好、简便易操作，可以用于穿心莲中总黄酮的成分测定。穿心莲二萜内酯类成分为穿心莲抗肿瘤的有效成分群，穿心莲内酯是穿心莲中抗肿瘤的主要有效成分，A和DDA(12∶1)的配伍对LLC肿瘤细胞株抑制作用优于其他各配伍组，具有较好的药效。基本明确了穿心莲有效部位在抑制4T-1及LLC肿瘤细胞株生长方面的不同药效物质基础。

目录

声明

摘要

附录：中英文缩略词表

第一章 前言

1．中药穿心莲的研究现状与临床应用概况

1．1 穿心莲化学成分研究进展

1．2 穿心莲药理作用研究进展

1．3 临床应用

2．穿心莲主要有效成分的含量测定

2．1 二萜内酯类的多指标含量测定

2．2 总黄酮类的含量测定

3．中药药效物质基础研究方法

3．1 活性追踪

3．2 拆方研究

3．3 体内化学成分研究

3．4 化学信息学方法

4．本课题研究意义

第二章 穿心莲中二萜内酯类有效成分QAMS分析

1．实验材料

1．1 药品和试剂

1．2 实验仪器

1．3 溶液配置

2．方法与结果

2．1 二萜内酯类的多指标含量测定方法的建立

2．2 相对校正因子的测定

2．3 校正因子的重现性考察

2．4 一测多评法与常规法结果比较研究

2．5 样品的测定

3．讨论

3．1 检测波长的确定

3．2 待测组分色谱峰的确认

3．3 内参物的选择

第三章 紫外分光光度法测定穿心莲中总黄酮含量

1．实验材料

1．1 仪器和试剂

1．2 溶液配置

2．实验方法和结果

2．1 显色条件考察

2．2 标准曲线考察

2．3 精密度考察

2．4 稳定性考察

2．5 加样回收率考察

2．6 含量测定

3．讨论

第四章 有效成分配伍对抗肿瘤活性影响的实验研究

1．实验材料

1．1 细胞株

1．2 药品和试剂

1．3 实验仪器

2．实验方法

2．1 成分剔除法的实验设计

2．2 单形格子实验设计

2．3 样品的制备

2．4 MTT法

2．5 实验优化设计

2．6 数据处理

3．实验结果

3．1 穿心莲乙醇提取物及有效部位IC50的测定

3．2 成分剔除实验结果

3．3 单形格子实验结果

3．4 优化组方的验证

4．讨论

第五章 全文小结

1．小结

1．1 穿心莲—测多评方法的应用

1．2 穿心莲提取物中总黄酮含量测定研究

1．3 有效成分配伍对其抗肿瘤活性影响的研究

2．问题与展望

参考文献

致谢

参与项目