拟南芥miR156及SPL家族开启低磷响应过程的分子机制

摘要

植物在生长发育过程中，低磷是一种常见的逆境胁迫。植物已经演变出许多策略来应对磷胁迫：例如，根部形态发生变化（包括侧根和根毛）来增加植物根部的磷吸收面积；根部产生和分泌酸性磷酸酶和有机酸来促进土壤中无机磷的溶解；一系列磷饥饿响应基因被激活，使无机磷转运蛋白含量和活性增加，从而促进无机磷的跨膜转运和吸收。虽然很多参与低磷调控网络的转录因子和相关酶类已经被鉴定出来，但植物是如何感知低磷信号并作出相应反应，其分子机制仍不是十分清楚。
　　MicroRNAs（miRNAs）是低磷信号中的重要组成部分。最近研究发现，miR399和它的靶基因PHO2参与了拟南芥中的磷平衡过程。在PHO2所参与的信号途径中，miR399及PHO2的上下游成分已经被鉴定出来。PHR1位于miR399的上游，转录激活子AtMYB2调节miR399的表达。miR399的靶基因PHO2通过质膜上无机磷的分泌途径调节PHT1的蛋白量，并且还通过对PHO1的降解调节了无机磷在木质部的装载。因此，miR399在响应低磷的整个调控网络中起到了重要的作用。在本研究中，我们探讨了miR156和SPL家族成员在磷胁迫响应过程中的调节作用以及miR156和miR399在低磷条件下的对话机制。
　　本研究中我们利用T-DNA库，从中筛选出了一种低磷诱导根际酸化缺失突变体，通过Tail-PCR技术发现突变体中T-DNA插入到SPL1的5′-UTR区。SPL（SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE）家族是植物所特有的转录因子家族，其中10个成员受miR156调控，而SPL1属于不受miR156调控的第I类亚家族。受miR156调控的SPL基因因其参与了植物生长、发育及代谢等许多生理过程而被广泛关注。因此本研究我们重点探索了miR156–SPL3组件在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中参与低磷响应的作用。
　　在低磷条件下，受miR156调控的SPL基因表达均受到抑制，而SPL3的表达受抑制最为明显。35S:rSPL3（miR156不敏感型）转基因植株在低磷条件下表现出根际酸化能力降低和花青素积累减少的表型，表明35S:rSPL3植株对低磷胁迫不敏感。与野生型相比，35S:rSPL3植株的无机磷含量和磷吸收增加。另外，spl3-1突变体的根毛数量及长度也显著增加。这些结果表明35S:rSPL3植株参与了低磷胁迫响应的许多生理过程。
　　在低磷条件下，WT植株的叶片及根部中的miR156均受诱导。35S:MIR156转基因植株根际酸化能力增强，而35S:MIM156（通过靶标模拟使miR156功能降低）转基因植株根际酸化能力缺失。并且它们参与了质子外排和H+-ATPase活性的调控过程。与35S:rSPL3植株相类似，35S:MIM156植株表现出花青素积累减少和Pi含量升高的表型。与spl3-1突变体的表型相一致，35S:MIR156植株的根毛长度和数量比野生型增加。而35S:MIM156植株表现出侧根数目和长度减少的表型。这些均表明miR156同样参与了响应低磷的一系列生理过程和根部形态的调控过程。
　　为了探究SPL家族的其他成员是否也参与了低磷响应过程，我们获得了35S:rSPL335S:rSPL9双突变体材料。在低磷条件下，与35S:MIM156植株的表型相类似，35S:rSPL335S:rSPL9双突变体表现出花青素积累变少，侧根的数目和长度减少以及叶片的无机磷含量升高的表型。上述结果表明SPL家族的SPL9也参与了低磷响应过程，SPL3和SPL9在响应低磷过程中可能起主要作用。
　　几个典型的磷饥饿诱导基因在35S:MIM156和35S:rSPL3植株中表达量升高，其中包括高亲和磷转运蛋白Pht1;5，磷脂酶PLDZ2，酸性磷酸酶ACP5和核酸酶RNS1。染色质免疫沉淀、凝胶迁移实验和瞬时表达分析表明SPL3蛋白可以直接结合PLDZ2和Pht1;5启动子区的GTAC模块。另外，染色质免疫沉淀和凝胶迁移实验证明了SPL3蛋白可以直接结合miR399f启动子区的GTAC顺式作用元件，暗示了miR156可能位于miR399的上游。
　　综上所述，我们认为miR156及SPL家族开启了植物一系列的低磷响应过程，并通过调控下游基因Pht1;5、PLDZ2及miR399形成拟南芥中响应低磷的信号通路。对miR156及SPL家族的功能分析将加深我们对低磷条件下高等植物转录调控的理解。本研究揭示了SPL家族成员参与低磷胁迫响应的分子机制，miR156–SPLs组件可能在植物的发育和胁迫响应方面起到了广泛而重要的作用。

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缩写表

文献综述

1 植物低磷胁迫的研究进展

1.1 植物的低磷胁迫反应

1.2 拟南芥中低磷反应的调控网络

2 miR156及SPL家族参与生长发育及非生物胁迫过程

2.1 miR156及其SPL家族的命名及结构

2.2 miR156对SPL转录因子的表达调控

2.3 miR156及SPL家族的功能多样性

2.4展望

3 实验目的和意义

研究报告

4 拟南芥SPL3参与低磷响应过程的生理实验证据

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

5 拟南芥miR156及SPL家族其他成员开启低磷响应过程的生理实验证据

5.1 引言

5.2 实验材料

5.3 实验方法

5.4 结果与分析

5.5 讨论

6 miR156-SPL开启低磷胁迫响应的分子机制

6.1 引言

6.2 实验材料

6.3 实验方法

6.4 结果与分析

6.5 讨论

7 结论

8 参考文献

致谢

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