基于RNA-seq的油菜抗旱基因的高通量克隆和功能分析

摘要

油菜属十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）的双子叶植物，是我国种植面积最广的一种油料作物。但是，近年来，由于全球气温不断上升，使旱灾频繁发生，对油菜的生产产生了极其不利的影响。在油菜的整个生长发育过程中，干旱在一定程度上成为制约油菜生产产量的主要因素。研究表明，植物在干旱胁迫条件下，细胞内有数千个基因的表达量发生了不同程度的变化，这些基因中有很多对植物的抗旱性起到至关重要的作用。因此通过基因工程的手段，将这些耐旱基因转入到油菜中，培育耐旱种质资源，提高油菜的干旱耐受能力，从而减少干旱造成的损失，成为油菜生产需要迫切解决的关键问题。找出油菜的耐旱基因，是顺利进行油菜抗旱育种的基础。在逆境胁迫下，研究人员比较抗逆性不同的相近物种转录组的差异，不仅能够大量找出抗逆相关基因，而且还能分析其潜在的抗逆分子机理。转录组分析不仅能够揭示基因的表达水平变化、基因的结构变化、还能发现新的基因。
　　本研究主要内容包括：⑴通过RNA-Seq所得数据，经过分析获得了107,294条Unigenes片段。用这些片段开发潜在的微卫星标记，一共筛选到22,414个潜在的EST-SSR标记，其中3,464条序列包含了不止一个EST-SSR标记，1,425个EST-SSR标记以化合物的形式出现。⑵通过GO和COG进行功能分类，75,278条序列被分为57个功能基因组。代谢通路分析发现107,294个Unigenes片段中有45,861条匹配度很高，属于128个KEGG通路，通路里最具有代表性的是涉及代谢途径的Pathway，其次包括生物合成过程的次生代谢途径、植物病原体互作途径和植物激素信号转导途径。这些为我们在以后油菜研究中分析具体的生物过程、功能和通路提供了有价值的信息。⑶共得到639个差异表达的Unigenes片段，经过同源比对，获得53条高度同源的具有完整读码框的EST序列。以抗旱株系R29的cDNA为模板，克隆到抗逆相关基因28条。利用Gateway技术构建了35S强启动子驱动的这28个基因的入门载体和植物表达载体文库。⑷农杆菌介导的拟南芥花浸染技术转化500多株Col-0生态型拟南芥，收获T0代种子约2万粒。抗生素筛选和分子鉴定得到235株T1代阳性植株，其中215个单株收到种子。繁殖一代后，通过模拟胁迫条件筛选，在Mannitol、NaCl和ABA板上分别得到具有抗逆表型突变植株163株、384株和366株。挑出表型明显的阳性植株测序，比对分析后初步得到具有抗逆表型的油菜基因20个。从农杆菌文库中筛选出这20个基因的单克隆并转化油菜，以验证其功能。

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1 前 言

1.1 植物干旱相关基因的研究进展

1.2 转录组测序（RNA-seq）

1.3 FOX hunting system和Gateway技术

1.4 本研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 常用仪器

2.3 实验试剂与药品

2.4 基础实验方法

2.5 RNA-seq流程及数据处理

2.6 油菜差异基因的筛选

2.7 文库构建

2.8 转基因材料筛选鉴定

2.9 油菜的遗传转化

结果分析

3.1 RNA-Seq结果

3.2 基因克隆与文库构建

3.3 油菜FOX拟南芥突变体库构建

3.4 FOX拟南芥突变体库的筛选

3.5 纯合体的筛选及表型重复

3.6 油菜的遗传转化与筛选

4 讨 论

4.1 转录组测序

4.2 测序材料的选取

4.3 基因文库的构建

4.4 FOX文库表型的初步筛选

5 结 论

参考文献

致谢