杜氏利什曼原虫NH36基因的克隆与表达

摘要

内脏利什曼原虫病(visceral leishmaniasis，VL)是一种重要的人兽共患寄生虫病，其病原为杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)复合体。原虫都属于嘌呤营养缺陷型生物，只能依靠补救途径合成嘌呤。核苷水解酶(Nucleoside hydrolases，NH)对原虫核苷酸补救途径具有关键作用。研究表明，NH在利什曼原虫病诊断、疫苗免疫和作为哺乳动物利什曼病治疗药物成分等方面具有很好的应用前景，但目前我国对利什曼原虫NH的研究尚属空白。 重组蛋白疫苗以及核酸疫苗对于VL的免疫预防具有关键作用，L.donovani核苷水解酶36(L.d NH36)是其主要抗原复合体-岩藻糖-甘露糖配体复合体(fucose-mannose ligand，FML)的主要免疫原性片段，因而，本研究建立了我国SC10H2株L.donovani的体外纯培养，应用RT-PCR技术扩增并克隆L.d NH36编码基因，经鉴定及序列分析，构建其原核重组表达载体pET-28a-L.d-NH36，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Westem blotting鉴定，证明了L.d NH36重组蛋白得到了成功表达；制备并纯化了L.dNH36重组蛋白，腹腔免疫BALB/c鼠，采用流式细胞仪对诱导产生的细胞免疫应答进行检测；最后构建了L.d NH36真核重组表达质粒pVAXl-L.d-NH36，脂质体介导转染Hela细胞后对其表达情况进行鉴定。结果表明，获得的NH36ORF为945 bp，编码314个氨基酸残基，与国际标准株MHOM/KE/1975/MutingaH9比对，基因序列以及氨基酸序列同源性分别为88.78％和89.49％；表达蛋白为36KD，经lmmoI/L IPTG诱导6 h后表达量最高，薄层扫描显示表达的蛋白占菌体蛋白总量的57％，该蛋白可被抗L.donovani的多克隆抗血清识别；L.dNH36重组蛋白免疫后试验组小鼠脾细胞流式细胞仪分析表明CD4<'+>T淋巴细胞进行了的增殖，可诱导机体产生一定水平的细胞免疫应答；通过RT-PCR技术从转染的Hela细胞中扩增出特异目的条带，转染细胞裂解液经Westem blotting检测，结果呈阳性。 L.donovani SC10H2株NH36基因的成功克隆与表达为VL免疫机理、分子生物学诊断、免疫预防和治疗等方面的研究奠定了基础，也有助于Leishmania分子系统发生学的研究。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

第一章引言

1.1利什曼原虫病研究进展

1.2原虫核苷水解酶的研究进展

1.3本研究的目的和意义

第二章杜氏利什曼原虫的体外纯培养

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第三章杜氏利什曼原虫NH36基因的克隆与序列分析

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

第四章杜氏利什曼原虫NH36基因的表达

4.1材料与方法

4.2结果

4.3讨论

第五章NH36重组蛋白免疫BALB/C鼠的效果检测

5.1材料与方法

5.2结果

5.3讨论

第六章结论

参考文献

致谢

附录

个人简历