环孢霉素A对实验性干眼的疗效观察及对角膜上皮细胞调亡和相关基因表达的影响

摘要

目的：干眼是指由于泪液分泌减少或过度蒸发导致泪膜异常的一种常见疾病。泪膜随着水分的丢失变的不稳定，眼表亦随之逐渐退化。干眼发病率较高，成年人中10-15％患有此病，随着社会老龄化、角膜接触镜的使用以及微机的普及等，其发病率越来越高。干眼的临床症状主要表现为干涩、眼红、异物感或磨砂样感、痒感、烧灼感、流泪、粘性分泌物及视力模糊等，常年累月的不适降低了患者的生活质量。目前干眼的治疗主要是局部滴用人工泪液改善症状，必要时加用抗感染药物，但人工泪液必须频繁点眼方可奏效。随着研究的深入，逐渐认识到频繁应用的滴眼液中所含氯化苯甲羟胺等防腐剂对眼表上皮有毒性作用，从而限制了这些药物的频繁和长期使用。据文献报道干眼的发生与机体免疫有关，环孢霉素A是一种免疫抑制剂，可刺激T细胞活性、减少许多炎症因子的产生、降低结膜炎性因子白细胞介素-6的水平，从而改善干眼症状。本实验对干眼兔局部滴用环孢霉素A进行治疗，观察其对实验性干眼的疗效及对角膜上皮细胞凋亡和相关基因表达的影响，旨在找出滴眼次数少、毒副作用小且能改善症状的治疗干眼药物，为临床治疗干眼提供依据。 方法：1本实验采用健康成年新西兰大白兔22只(河北医科大学第三医院实验动物中心)，体重2.5±0.5kg，雌雄不分，随机分为4组，分别为正常组(正常对照组)、治疗组(干眼造模后点环孢霉素A治疗)、对照组(干眼造模后点蓖麻油)和干眼组(干眼造模后不作任何干预)。正常组6只兔12眼，干眼组4只8眼，其余12只兔右侧12眼为治疗组，左侧12眼为对照组。对各组兔双眼行泪膜破裂时间(tearbreakuptime,BUT)、泪液分泌实验(schirmerⅠ，SIt)检查。 2干眼模型制作：治疗组、对照组和干眼组双眼手术摘取泪腺、哈氏腺和瞬膜，于手术后每周分别查SIt、BUT,根据诊断标准第5周末确诊为干眼。 3自术后第6周开始点眼，治疗组予以2％环孢霉素A点眼，3次/日、2滴/次，共点6周，对照组予以蓖麻油点眼，用法同治疗组。点眼后2、4、6周查SIt、BUT并与正常组及干眼组做比较。 4病理取材：治疗后第6周处死实验动物，取角膜、鼻侧球结膜，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，制片备用。5TUNEL试剂盒检测干眼组、对照组、治疗组和正常组角膜上皮细胞凋亡数量，计算每高倍视野下(400倍)凋亡细胞数，计算平均捌亡细胞数。 6免疫组织化学检查：检测各组角膜上皮细胞Fas/FasL的表达，并分析其表达的高低与细胞捌亡的相关性。 7结膜组织制成切片后行PAS染色，观察治疗前后杯状细胞的变化。 8采用SPSS11.5软件包进行统计学分析。结果：1泪腺摘除术前治疗组、对照组、干眼组和正常组各组间SIt和BUT检查结果与正常相比差异无显著性(p＞0.05)，术后SIt和BUT随时间延长数值逐渐下降，每次检测结果与正常组相比均有显著差异，但1-4周末未达到干眼诊断标准，直到第5周时各项指标符合干眼诊断标准 2治疗后2周治疗组、对照组和干眼组SIt和BUT检查结果两两比较统计学分析差异无显著性(p＞0.05)；治疗后4周和6周SIt和BUT检查结果正常组＞治疗组＞对照组＞干眼组，经统计学分析均有显著性差异(p＜0.01)。 3裂隙灯检查可见干眼组兔角膜干燥少光泽，荧光素染色见散在点片状着色，结膜和睑缘充血，有多量异常分泌物，炎症明显。治疗后结膜和睑缘充血减轻，治疗组荧光素染色无着色，对照组见散在点状着色. 4TUNEL试剂盒检测干眼组、对照组和治疗组角膜上皮中捌亡细胞数分别为(6.21±2.12)、(3.42±1.32)和(1.27±0.14)个/高倍视野，凋亡细胞核呈棕黄色，三组数据经统计学检验差异有显著性(p＜0.01)。 5免疫组织化学检查捌亡相关基因蛋白Fas/FasL主要表达于细胞膜和细胞浆，阳性反应物呈棕黄色，阳性表达细胞的数量干眼组＞对照组＞治疗组＞正常组，经统计学分析各组间差异有显著性. 6组织病理学观察干眼组结膜杯状细胞数量减少，上皮细胞排列不规则，可见大量淋巴细胞浸润；角膜上皮变薄，上皮细胞不完整，细胞核变小；治疗组结膜杯状细胞数量较干眼组明显增加，但仍较正常组少，细胞排列较规则，淋巴细胞浸润减少，角膜上皮细胞层变厚，接近正常，治疗组明显好于对照组，对照组略好于干眼组，但较治疗组差。 结论：本实验通过摘取泪腺获取水液缺乏型干眼兔模型，治疗组进行局部环孢霉素A治疗，因环孢霉素A为脂溶性，实验和临床中常选用蓖麻油为溶剂，故对照组选用蓖麻油进行局部治疗，治疗6周后，综合各项指标，并进行病理学、免疫组化学研究，Fas/FasL等相关基因蛋白的表达进行检测，得出如下结论： 1环孢霉素能够减轻结膜炎症，恢复或部分恢复杯状细胞功能从而增加泪液，对干眼病有潜在的治疗作用。 2干眼兔经用环孢霉素A点眼后，BUT时间延长、SIt增加的程度明显优于单纯使用蓖麻油，证实环孢霉素A除了对眼表有润滑作用外，确有治疗作用。 3环孢霉素A能减缓角膜上皮的捌亡。 4兔干眼模型角膜上皮Fas/FasL阳性表达细胞数与凋亡数间呈正相关，推测干眼角膜上皮细胞的凋亡很可能是由Fas/FasL途径介导的。 关健词：环孢霉素A；干眼；角膜上皮细胞；捌亡；Fas/FasL

目录

前言

材料与方法

结果

附图1

附图2

附图3

附表

讨论

结论

参考文献

综述 环孢霉素对干眼的治疗研究

致谢

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