重组人肿瘤坏死因子α联合紫杉醇诱导涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的实验研究

摘要

本实验研究通过体外实验，探讨rhTNF-α联合紫杉醇对腺样囊性癌细胞的抑制增殖作用、作用机制以及与细胞凋亡的关系，以期为化疗与生物治疗联合应用治疗腺样囊性癌提供实验依据。 研究方法： 1.研究材料 1.1.实验材料：人涎腺腺样囊性癌细胞系(SACC-83)、新生鼠肺成纤维细胞(L929)。 1.2.药品：重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)、紫杉醇(paclitaxel)。 1.3.实验动物：新生Balb/c乳鼠。 2.方法： 2.1.细胞培养：取人涎腺腺样囊性癌细胞(SACC-83)按常规贴壁细胞法于RPMI1640培养液中(含胎牛血清及双抗)在5％CO237℃的细胞培养箱内培养，取对数生长期的细胞进行实验。同时原代培养鼠肺成纤维细胞(L929)作为对照。 2.2.实验分组：根据不同药物浓度分为9组，药物作用72h。①对照组：加入不含药物的培养液；②T组：rhTNF-α终浓度为150U/ml；③T'组：rhTNF-α终浓度为：1500U/ml：④P组：紫杉醇的终浓度为0.0365μg/ml；⑤P'组：紫杉醇的终浓度为0.365μg/ml；⑥T+P组：含有终浓度rhTNF-α150U/ml和紫杉醇0.0365μg/ml；⑦T+P'组：含有终浓度rhTNF-α150U/ml和紫杉醇0.365μg/ml；⑧T'+P组：含有终浓度rhTNF-α1500U/ml和紫杉醇0.0365μg/ml：⑨T'+P'组：含有终浓度rhTNF-α1500U/ml和紫杉醇0.365μg/ml； 2.3.检测：①MTT法测细胞增殖抑制率。②流式细胞术检测细胞调亡率及细胞周期改变。③光镜下观察凋亡细胞形态。④在电镜下观察凋亡细胞形态学改变。 研究结果： 1.形态学观察： 1.1.SACC-83细胞单层生长，胞体较大，呈上皮样多角形镶嵌状排列，可见较多核分裂像。加入TNF-α72h后，SACC-83细胞形态发生变化，细胞大多呈梭形或细长形，类似于成纤维细胞，形态相对规则，核浆比例减小。细胞堆集生长现象减少，大多散在生长，呈放射状、漩涡状分布，多边形镶嵌样生长状态逐渐消失。 1.2.L929细胞贴壁生长，呈漩涡状分布。细胞体呈梭形，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。 2.MTT法： 2.1.SACC-83细胞：细胞增殖抑制率T组为23.54％，T'组为22.41％，P组为41.42％，P'组为48.26％，T+P组为55.68％，T+P'组为57.86％，T'+P组为55.19％，T'+P'组为62.72％。联合用药组的细胞增殖抑制率显著高于单独用药组(P＜0.05)。 2.2.L929细胞：细胞增殖抑制率T组为-0.98％，T'组为-8.06％，P组为17.44％，P'组为26.83％，T+P组为3.90％，T+P'组为21.26％，T'+P组为-0.61％，T'+P'组为20.96％。L929细胞各组的细胞增殖抑制率显著低于SACC-83细胞(P＜0.05)。 3.光镜下观察：肿瘤细胞圆形、多边形，胞核圆形，居中，核分裂象易见。实验组中可见部分SACC-83细胞及细胞核体积缩小，染色质浓缩或边集，成块状或新月状，胞浆固缩。对照组的SACC-83细胞成片排列，细胞质及核染色质均匀，未见凋亡细胞。 4.透射电镜观察：可见实验组的SACC-83出现：细胞皱缩，胞体、胞核缩小，细胞表面纤毛丧失，染色质固缩，呈块状或颗粒边集于核膜内侧，电子密度增高，亦可见凋亡小体。对照组的SACC-83细胞成片排列，偶见凋亡细胞。 5.流式细胞仪分析： 5.1凋亡率：检测SACC-83细胞各组均有凋亡峰形成。其中对照组的凋亡率为3.90±0.40％，T组凋亡率为2.25±0.45％，T'组凋亡率为2.63±0.48％；P组凋亡率为12.17±1.92％，P'组凋亡率为16.12±2.03％；T+P组凋亡率为15.60土2.20％，T+P'组凋亡率为21.63±2.11％，T'+P组凋亡率为16.43±1.98％，T'+P'组凋亡率为25.25±4.35％。T+P'组与T'+P'组的细胞凋亡率高于其他实验组(P＜0.05)。L929细胞各组无凋亡峰形成，其中对照组的凋亡率为0.83±0.08％，T组凋亡率为0.43±0.09％，T'组凋亡率为2.51±0.45％；P组凋亡率为3.03±1.02％，P'组凋亡率为1.57±0.85％；T+P组凋亡率为1.38±0.63％，T+P'细凋亡率为2.45±1.08％，T'+P组凋亡率为2.06±0.52％，T'+P'组凋亡率为2.44±1.85％。与对照组相比，各实验组的凋亡率没有显著差异(P＞0.05)，组间两两比较亦无明显差异(P＞0.05)。 5.2细胞周期：SACC-83细胞加入紫杉醇的实验组G2M期细胞数目较对照组发生了明显的增多(P＜0.05)：P组G2M期细胞数占34.10±3.30％，P'组G2M期细胞数占41.77±7.70％，T+P组G2M期细胞数占44.57±8.18％，T+P'组G2M期细胞数占45.57±6.52％，T'+P组G2M期细胞数占44.70±4.25％，T'+P'组G2M期细胞数占47.03±2.40％；T组、T'组的G2M期细胞数较对照组无显著差异(P＞0.05)。联合用药组的G2M期细胞数比紫杉醇组有增多的趋势(P＞0.05)。L929细胞中加入紫杉醇的实验组G2M期细胞较对照组与T组、T'组G2M期细胞数显著增加(P＜0.05)，联合用药组与单独紫杉醇组间无显著差异(P＞0.05)。 研究 结论： 1.TNF-α可以抑制SACC-83细胞增殖，除可诱导SACC83细胞发生凋亡以外，还对SACC-83细胞具有诱导分化作用。 2.紫杉醇对SACC-83抑制率随药物浓度增加而增大，紫杉醇抑制SACC-83细胞增殖的机制和诱导细胞发生凋亡有关，使细胞发生G2/M期阻滞。 3.TNF-α联合紫杉醇对SACC-83细胞增殖的抑制作用以及诱导凋亡都具有协同作用。

目录

前言

材料与方法

结果

附图1

附图2

附图3

附表

讨论

结论

参考文献

综述紫杉醇在涎腺肿瘤治疗中的研究进展

致谢

个人简历