寒凝血瘀证模型大鼠IL-1β、TNF-α的变化与卵巢功能的关系及加减温经汤对其影响

摘要

目的：人类的生殖活动受内分泌调节和免疫调节。月经病寒凝血瘀证可表现为月经过少、月经后期及闭经等内分泌失调疾病。本试验通过分析寒凝血瘀证模型大鼠血清和卵巢组织细胞因子的变化与卵巢功能的关系，揭示寒凝血瘀证妇科病的部分发病机理，探讨加减温经汤的干预调节机制，为中医妇科证候研究提供理论和实验依据。 方法：选用动情周期正常(4～5天)的健康清洁级SD雌性大鼠60只，鼠龄3个月，体重230±20g，随机分为6组，每组10只：即正常对照组(简称为“正常组”)，模型对照组(简称为“模型组”)，模型加加减温经汤低剂量组(简称为“低剂量组”)，模型加加减温经汤中剂量组(简称为“中剂量组”)，模型加加减温经汤高剂量组(简称为“高剂量组”，低剂量组、中剂量组、高剂量组又合称为“治疗组”)，桃红四物汤组(简称为“对照组”)。正常组常规饲养，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组大鼠置于0℃～1℃冰水中20分钟，每日一次，连续两周。低剂量组、中剂量组、高剂量组于造模的第一天开始，分别按7.33g、14.66g、29.32g/kg/日(分别相当于临床成人剂量的5倍、10倍、20倍)给予加减温经汤灌胃，每日一次，连用两周；对照组按10.83g/kg/日(相当于临床成人剂量的10倍)给予桃红四物汤灌胃，其它两组给予同体积的蒸馏水。自造模第一天起，每日定时进行阴道涂片，观察大鼠动情周期变化。末次造模给药后，禁食8小时，选择动情间期的大鼠断头取血，制备血清，放免法检测雌二醇(E2)、孕酮(P)、睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。无菌操作剖腹取出同一侧卵巢组织，吸去血迹，称重后置于4％多聚甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，5μm厚连续切片，进行免疫组织化学染色，观察卵巢组织白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)表达强度。 结果： 1大鼠动情周期的变化 模型组大鼠动情周期延长、间期延长，与正常组比较有显著性差异(均P＜0.01)，经加减温经汤治疗，中、高剂量组动情周期缩短，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01，P＜0.01)；对照组与模型组比较动情周期缩短，但其差异无统计学意义(P＞0.05)。各治疗组和对照组动情间期皆缩短，与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01P＜0.01，P＜0.05)，与正常组之间比较无统计学意义(均P＞0.05)。 2血清生殖激素变化 与正常组相比，模型组血清E2、P、T、FSH、LH均显著降低(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)。经加减温经汤治疗后，低剂量组E2有升高趋势，但与模型组比较无统计学意义(P＞0.05)，中、高剂量组和对照组E2升高，有统计学意义(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)。各治疗组和对照组P水平升高，与模型组比较均有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)。各治疗组和对照组的T和FSH水平均高于模型组，除高剂量组外，其余各组与模型组比较均无显著性差异。高、中、低剂量组和对照组LH升高，与模型组比较均有显著性差异(均P＜0.01)，其中高、中剂量组和对照组与正常组之间无显著性差异(P＞0.05)。 3血清IL-1β、TNF-α结果 与正常组相比，模型组血清IL-1β降低，TNF-α升高(均P＜0.01)。与模型组比较，加减温经汤中、高剂量组IL-1β升高(均P＜0.01)、TNF-α降低(P＜0.05，P＜0.01)。低剂量组IL-1β有升高趋势、TNF-α有降低趋势，但与模型组比较均无显著性差异(P＞0.05)。对照组TNF-α水平降低，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，IL-1β有升高趋势，与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。 4卵巢组织IL-β、TNF-α、NF-κBP65的表达 4.1卵巢组织IL-1β蛋白的表达情况 IL-1β阳性表达定位于细胞浆内，为棕黄色染色。在大鼠卵巢颗粒细胞、黄体细胞、卵泡液中均有表达，在髓质血管周围有少量表达。与正常组相比，模型组大鼠卵巢中IL-1β表达增强(P＜0.01)，灌服加减温经汤后，中、高剂量组IL-1β表达均低于模型组(P＜0.01，P＜0.01)，且中、高剂量组二者之间比较无显著性差异(P＞0.05)。低剂量组和对照组IL-1β表达与模型组比较虽有减少趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。高剂量组IL-1β表达水平低于低剂量组和对照组(P＜0.05，P＜0.05)。中、高剂量组与正常组比较无显著性差异(均P＞0.05)。 4.2卵巢组织TNF-α蛋白的表达情况 TNF-α阳性表达定位于细胞浆内，在大鼠黄体细胞、颗粒细胞、膜—间质细胞、髓质中均有表达。模型组TNF-α表达增多，与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)。低、中、高剂量组与对照组TNF-α表达均低于模型组(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)，低剂量组与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。高剂量组TNF-α表达低于低剂量组和对照组，差异有显著性(均P＜0.05)；高剂量组与正常组比较无显著性差异(P＞0.05)。 4.3卵巢组织NF-κBP65蛋白的表达情况 NF-κBP65蛋白阳性染色定位于胞浆和胞核内，主要分布于颗粒细胞、髓质血管和黄体细胞内。正常组大鼠NF-κB表达较少，多局限于胞浆，偶见细胞核阳性。模型组NF-κB多表达于胞核，其灰度值与正常组比较显著降低(P＜0.01)，说明NF-KB的表达较正常组增多。低剂量组NF-κB的表达量稍有下降，与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)；中、高剂量组和对照组NF-κB的表达与模型组比较均降低，差异有显著性(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)，其中中、高剂量组的表达低于低剂量组和对照组(均P＜0.05)，低剂量组和对照组NF-κB表达均高于正常组，差异有显著性(P＜0.01，P＜0.01)。中、高剂量组与正常组比较无显著性差异。(均P＞0.05) 5卵巢组织IL-β、TNF-α表达与NF-κB活性相关性分析 卵巢组织IL-β、TNF-α与NF-κB活性呈正相关(r=0.523，P＜0.01；r=0.662，P＜0.01)。 结论： 1寒凝血瘀证模型大鼠血清生殖激素水平低下，卵巢局部IL-1β，TNF-α含量增加，提示细胞因子的异常改变可能是导致卵巢功能紊乱的重要因素。 2寒凝血瘀证模型大鼠卵巢内NF-κB的活化增强，与IL-1β，TNF-α的蛋白表达显著正相关，提示卵巢内NF-κB在寒凝血瘀状态下可被某些因素刺激活化。NF-κB的过度激活可能与IL-1β，TNF-α的表达增强有关。 3加减温经汤通过调节卵巢内NF-κB的活性来下调细胞因子的表达，从而调节卵泡的发育和类固醇激素的生成。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述中医药调节女性生殖内分泌的实验研究概况

致谢

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