急性心肌梗死后冠脉内移植自体骨髓单个核细胞与间充质干细胞对心脏结构和功能的影响

摘要

目的：急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)是严重危害人类健康的常见多发病之一。由于AMI后坏死心肌细胞收缩功能的丢失，AMI发展到末期往往导致心力衰竭。虽然溶栓、经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)、激光心肌血运重建术(TMR)、冠状动脉旁路移植术(CABG)等治疗措施能够减少坏死心肌数量及减小梗死面积，但不能逆转坏死的心肌。近年有研究证明心肌梗死区周围的心肌细胞虽可以发生分裂，但修复梗死心肌的能力有限。目前，人们针对其病理生理机制提出了细胞水平心肌成形术(cellularcardiomyoplasty，CCM)，即用细胞移植的手段增加心肌细胞的数量，修复坏死的心肌，从而改善心功能，降低病死率，为MI的治疗提供了一种新思路。由于骨髓干细胞取材相对方便，不存在伦理问题，自体移植不存在免疫排斥反应，因而成为再生心肌的首选细胞供体。骨髓干细胞的组成很复杂，包括骨髓问充质干细胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)、造血干细胞(Hematopoieticstemcells，HSCs)、内皮祖细胞(Endothelialprogenitorcells，EPCs)、多潜能成体祖细胞(Multipotentadultprogenitorcells，MAPCs)以及其他功能不明的干细胞。由于分离和纯化方法不同，又可分为骨髓单个核细胞群(Bonemarrowmononuclearcells，BM-MNCs)、AC133阳性细胞、边缘细胞群(Sidepopulationcells，SP细胞)、Lin-、c-kit+细胞和各种单克隆干细胞等。BM-MNCs是抽得骨髓利用淋巴分离液(percoll液)经过梯度密度离心法得到的多个单核细胞混合。集成了所有的骨髓干细胞成分。MSCs存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓问充质中含量最为丰富，具有贴壁生长性、非吞噬性、成纤维细胞样和克隆性生长等生物特性。目前认为干细胞移植对于心肌梗死有一定的治疗作用，但对于二者治疗心梗的比较研究却很少。本研究拟用实验动物猪建立AMI模型，抽取骨髓，分离得到BM-MNCs，并加以培养获得MSCs，使用诱导剂促其向心肌细胞分化。使用冠脉介入的方法将BM-MNCs及诱导的MSCs移植入心梗部位。比较二者对实验动物心脏结构和功能的改变，探讨冠脉内移植诱导的MSCs能否进一步改善心肌梗死后短期内心脏的结构和功能，为今后的临床治疗提供依据。 方法：选择36只8～12个月龄的小型猪为实验对象。随机分为三组：骨髓单个核细胞移植组(BM-MNCs移植组)、经诱导骨髓间充质干细胞移植组(MSCs移植组)、对照组每组12只。 术前抽取BM-MNCs移植组及MSCs移植组实验用猪的骨髓，分离获得BM-MNCs。MSCs移植组先将骨髓单个核细胞筛选、分离、培养获得MSCs，培养至第2代时加用5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-AZA)诱导培养24h。移植术前均使用胶体金标记。 麻醉后，使用穿刺或切开直视穿刺方法在股动脉或颈外动脉置入鞘管，行冠脉造影，于前降支的第一对角支以远使用球囊阻断血流，制作AMI模型。60分钟后撤去球囊恢复血流。BM-MNCs移植组使用over-the-wire(OTW)球囊于前位置阻断血流后，注入骨髓单个核细胞。MSCs移植组以相同方法建立心梗模型并移植诱导培养的MSCs。对照组在制成心梗模型后用同样方法注入等量培养基。 分别于制模前及术4周后行超声心动图检查，探测左心室舒张期末直径(LVEDd)和收缩期末直径(LVEDs)，并计算左心室短轴缩短率(FS)，采用Simpson法测量并计算左心室射血分数(LVEF)作为心脏收缩功能的指标。同时探测主动脉(AO)宽度，舒张末期室间隔厚度(IVS)，左房内径(LA),左室后壁厚度(LVPW)以及LVEDd和LVEDs作为心脏结构改变的指标。使用16节段分段法计算室壁节段运动指数(WMSI)。 细胞移植术后4周处死实验动物，取心脏标本，观察室壁瘤出现情况，分别于梗死区、梗死边缘区及正常区域取得心肌标本，分别用于光镜检查及透射电镜检查。光镜标本固定、包埋、切片并行HE染色，每张HE切片随机取8个视野，计算每高倍镜(×400)视野的毛细血管数的总量，每个样本观察5张切片，取平均值。透射电镜观察胶体金标记的移植细胞的存活、分化情况。 所有数据输入SPSS11.0统计软件包进行统计。计量资料以均数±标准差表示；组内造模前后自身对照使用配对T检验；组问使用单因素方差分析，如有统计学差异则进行两两比较的q检验；检验水准以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果： 1造模结果27只实验动物存活。术后心电图及心肌钙蛋白I证实心梗模型制作成功。 2超声心动图结果 2.1术前BM-MNCs移植组、MSCs移植组及对照组的LVEF分别为(64.81±4.69％；60.86±6.04％；64.28±4.17％)，FS分别为(34.79±3.44％；31.59±4.72％；34.47±3.19％)，三组之间差异无统计学意义(P分别为0.2064和0.1659)。术后4周，三组LVEF分别为(58.52±4.86％；56.55±5.45％；46.46±9.84％)，FS分别为(30.27±3.17％；28.92±3.48％；23.18±6.00％)三组间差别有统计学意义(P分别为0.0031和0.0058)，两移植组均高于对照组。BM-MNCs移植组LVEF、FS略高于MSCs移植组，但差异无统计学意义(P＞0.05)。与术前相比，三组术后4周LVEF、FS均下降，差别有统计学意义(P均＜0.05)。 2.2三组问AO、LA、LVEDd及LVEDs术前均无差异(P均＞0.05)，术后4周较术前均有不同程度的增加，对照组的LA、LVEDd及LVEDs扩张较两移植组大，差异有统计学意义，P值分别为0.0351；0.0023和0.0001；AO无差异(P=0.1522)；三组IVS和LVPW术后4周均较术前减小，其中IVS差异有统计学意义(P=0.0404)，对照组比移植组变薄更显著；LVPW差异无统计学意义(P=0.1763)。BM-MNCs移植组与MSCs移植组之间差别均无统计学意义(P＞0.05)。与术前相比，BM-MNCs移植组的LA及对照组的LA、IVS、LVEDd及LVEDs差异有统计学意义(P均＜0.05)。 2.3WMSI结果显示：两移植组指数均小于对照组，差异有统计学意义(P=0.0278)。两移植组间无差异(P＞0.05)。3组织学结果HE染色切片显示心梗区心肌为纤维组织所代替，其间残存少量心肌，BM-MNCs移植组切片中出现钙化灶。血管密度显示，两移植组的梗死区、梗死边缘区及正常心肌区中毛细血管数量明显高于对照组(P均＜0.05)，而两移植组间则未见差异(P＞0.05)。透射电镜下MSCs移植组观察到胞质内含有胶体金的不成熟心肌细胞。 结论： 1介入冠脉内自体干细胞移植治疗急性心肌梗死在方法上是可行的。 2AMI再通血管后给予BM-MNCs及MSCs在冠脉内移植，对于梗死心脏的收缩功能有改善作用。并能减缓左室重构进程，减轻心室扩张。但在心梗后短期(4周)二者治疗效果无显著差异 3AMI再通血管后给予BM-MNCs及MSCs在冠脉内移植，均能促进毛细血管新生，改善心脏供血。但在心梗后短期(4周)二者亦无显著差异。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 干细胞移植与心肌重建研究进展

致谢

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