NGF/VEGF基因治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的治疗时间窗及MR影像学研究

摘要

第一部分：放射学引导下兔局灶性脑缺血再灌注模型的制作和质控体系的建立 目的：通过摸索兔局灶性脑缺血模型的制作方法，探讨量化实验动物模型制作的质量控制体系和评价体系，从而建立适合影像学评价的稳定可控重复性好的兔局灶性脑缺血再灌注模型。 方法：实验动物按照不同的量化指标分为六组，其中A组，不同品种的家兔；B组，不同的线栓；C组，不同栓塞时间(1h、2h、3h、4h)：D组，不同月龄(4-8月)、不同体重(2.0-5.0kg)的家兔；E组，不同手术入路；F组，不同的再灌注时间。其中A组行颈内动脉血管造影；B-E组统计成功率、死亡率、进行神经功能缺损评分及磁共振成像和形态学观察；F组于再灌注后不同时间点对实验动物进行神经功能缺损评分、磁共振成像及TTC染色观察。 结果：选用健康、雄性，体重2.5-3.0kg、4.5-5 月的新西兰白兔作为实验动物，直径为0.53mm的导丝作为线栓材料，在X线透视引导下行大脑中动脉阻塞，同时术前、术中、术后严格监控血气、血糖变化和其他影响因素，可有效地提高成功率、降低死亡率。综合影像技术、神经功能缺损评分及 TTC 染色是评价模型的理想体系。 结论：合理选择实验动物、量化影响因素、建立完善的术前、术中和术后三级评价体系，是建立稳定、可控的实验模型的必要条件，也是进一步开展缺血再灌注的病理生理变化的研究和MR影像学研究的基础。 第二部分：多参数MRI动态评价兔局灶性脑缺血再灌注模型的时间和组织特征性 目的：利用多参数MRI研究兔局灶性脑缺血再灌注模型，探讨脑缺血再灌注不同时间点的动态变化规律。 方法：建立兔局灶性脑缺血再灌注模型，78 只雄性新西兰白兔，随机分为三组，其中A组6只，为空白对照组；B组12只，为假手术对照组；C组60只，为缺血再灌注组。采用改良颈内动脉线栓造模方法，将导丝置入颈内动脉，阻闭左侧大脑中动脉2h后抽出导丝恢复再灌注，于再灌注后1h、3h、6h、1d、3d、7d(均n=10)对实验动物进行行为评分、MRI、大体观察、光镜和电镜检查。 结果：空白对照组、假手术组在各序列MRI上未见异常信号，模型组在缺血再灌注后不同时间均可在MRI表现出不同程度的脑组织损害征象。从再灌注Oh到7d所有实验动物组织学检测均与不同参数(T2-，T1-，diffusion- and perfusion-weighted imaging)得到的数据相一致。 结论：应用多参数MR影像学对局灶性脑缺血再灌注模型进行动态评价，从而明确缺血再灌注时间和组织特征性，为进一步研究脑缺血的诊断和治疗奠定基础。 第三部分：NGF/VEGF基因治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的治疗时间窗及MR影像学评价 实验一：NGF对兔局灶性脑缺血再灌注损伤的治疗时间窗及MR影像学评价 目的：研究神经生长因子(NGF)对脑缺血再灌注损伤保护作用的有效时间窗，同时利用先进的MR成像技术进行评价。 方法：采用兔大脑中动脉阻断(MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型，分别在缺血2h再灌注损伤后0h、1h、3h和6h应用微量进样器将NGF立体定向导入梗死灶周，于再灌注72h，应用MR影像学、分子生物学、流式细胞学观察梗死体积、水肿体积、神经功能缺损、灶周凋亡率、表观弥散系数比值(ADCR)和caspase-3蛋白表达。 结果：缺血再灌注0h、1h、3h灶周给予NGF，梗死体积分别比对照组下降50.1％、48.4％、37.6％，相应的灶周凋亡率及caspase-3 含量明显下降，灶周ADCR升高；再灌注6h后给药，则无明显作用。相关分析显示梗死体积及ADCR的变化与caspase-3蛋白表达下降程度明显相关。 结论：NGF对兔局灶性脑缺血再灌注损伤的有效时间窗在再灌注损伤3h内，灶周缺血半暗带caspase-3 蛋白表达与治疗时间窗有关，NGF可通过减少caspase-3 蛋白的表达减少脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的发生。 实验二：VEGF治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的量效关系和神经保护治疗时间窗 目的：探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)对家兔局灶性脑缺血再灌注损伤的量．效治疗关系和有效神经保护治疗时间窗。 方法：采用兔大脑中动脉阻断(MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型，在缺血2h再灌注损伤后即刻应用微量进样器将不同剂量的VEGF165(1-25ng/μL，2.5ng/μL，5.0ng/μL)立体定向导入梗死灶周，并选择最适剂量，将给药时间延迟至1h，3h，6h，12h，于再灌注72h，观察梗死体积、灶周缺血半暗带caspase-3蛋白表达、凋亡率、ADC值比率(ADCR)，评价神经功能缺损。 结论：2.5ng/μL INEGF 应用治疗家兔局灶性脑缺血再灌注损伤可诱导血管发生和神经保护作用，是进一步研究和评价 VEGF 治疗效应的最佳剂量。VEGF 对兔局灶性脑缺血再灌注损伤的有效治疗时间窗在再灌注损伤1h内。 实验三：NGF 和VEGF 联合应用拓宽局灶性脑缺血再灌注损伤神经保护治疗时间窗 目的：观察神经生长因子(NGF)和血管内皮生长因子(VEGF)对兔局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用，并探讨其发生机制。 方法：34只雄性4.5-5 月龄新西兰白兔随机数字表法分为假手术组(n=6)、生理盐水组(n=8)，再灌注3h因子治疗组(n=10)和再灌注6h因子治疗组(n=10)。采用兔大脑中动脉阻断局灶性脑缺血再灌注模型，假手术组线栓插入的深度不同。因子治疗组在缺血2h再灌注损伤后3 h和6 h应用微量进样器将2.5ng/μL VEGF165和NGF400AU(相当于16μg/L)50μL 立体定向导入梗死灶周，生理盐水组则注入同等剂量的生理盐水，于再灌注72h，应用MR影像学、TTC染色和流式细胞术评价各组动物脑梗死体积、灶周缺血半暗带细胞凋亡率、ADCR及caspase-3 活性表达。在大脑中动脉阻塞2 h再灌注后24 h、72 h采用Purdy评分标准行神经功能缺损评分。 第四部分：细胞外信号调节激酶在NGF/VEGF 介导的神经保护作用中的动态变化及其调控机制 目的：探讨细胞外信号调节激酶(estracellular signal-regulated kinase，ERK)在局灶性脑缺血/再灌注不同时间、不同脑区的动态时空变化，以及其在NGF/VEGF介导的神经保护作用中的调控表达机制。 方法：采用兔大脑中动脉阻断(MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型，应用免疫组化检测ERK1在脑缺血2h再灌注不同时间海马和皮层的动态表达规律，同时，应用免疫组化和流式细胞术检测caspase-3 和凋亡状态的动态变化，以及其在NGF/VEGF介导的神经保护作用中的表达。 结论：ERK 信号通路通过控制海马和灶周皮层死亡受体途径介导神经保护作用，抑制ERK 信号途径可能是预防缺血损伤过程中神经细胞死亡的有效方法。 第五部分：急性脑心综合征动物模型的建立及意义的初步探讨 在前期实验中，我们在X线透视引导下，应用导丝阻断大脑中动脉，从而建立了稳定可控重复性好的局灶性脑缺血再灌注模型。同时我们在实验中发现体重3.5-4.0kg、月龄5-6 月的家兔在造模时，于再灌注4-6h和24-30h易于发生心律失常和急性左心衰。分析这些信息，总结其它实验以及查阅文献，我们推断家兔发生了脑心综合征，其机制可能是中风后体内几种生物体液发生了改变。在此基础上，我们探讨了建立脑心综合征实验模型的可行性，表明这个模型具备研究脑心综合征的客观条件，同时指出研究脑心综合征的病理机制和治疗方法是今后的研究方向和热点。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分放射学引导下兔局灶性脑缺血再灌注模型的制作和质控体系的建立

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分多参数MRI动态评价兔局灶性脑缺血再灌注模型的时间和组织特征性研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分NGF/VEGF基因治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的治疗时间窗及MR影像学评价

前言

实验一NGF对兔局灶性脑缺血再灌注损伤的治疗时间窗及MR影像学评价

材料与方法

结果

讨论

实验二VEGF治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的量-效关系和神经保护治疗时间窗

材料与方法

结果

讨论

实验三NGF和VEGF联合应用拓宽局灶性脑缺血再灌注损伤神经保护治疗时间窗

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附图一

附图二

附表

第四部分细胞外信号调节激酶在NGF/VEGF介导的神经保护作用中的动态表达及其调控机制

前言

材料与方法

结果

附图一

附图二

附表

讨论

小结

参考文献

第五部分急性脑心综合征动物模型的建立及意义的初步探讨

前言

讨论

小结

参考文献

结论

综述一　MPI评价缺血性脑血管病实验模型的价值和进展

综述二　丝裂原活化蛋白激酶在脑缺血损伤中的作用及其调控机制

致谢

个人简历