壳多糖和外源性碱性成纤维细胞生长因子联合应用对创伤愈合影响的实验研究

摘要

目的：联合应用壳多糖(chitosan，CTS)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growt factor，bFGF)干预大鼠背部创伤模型，观察其对鼠背部创面愈合的影响，并探讨作用机制，为临床应用提供理论依据。 方法 1 实验动物：48只雄性健康Wistar大鼠，体重200g-250g，编号。 2 动物分组：将大鼠随机分为四组，即对照组、CTS组、bFGF组、CTS+bFGF组，每组均为12只。 3 创伤模型制备方法：腹腔注射10％水合氯醛(30mg/kg)麻醉，8％硫化钠背部脱毛备皮，面积为4×5cm<'2>。次日，麻醉成功后，将大鼠固定于手术台上。在背部脊柱两侧旁开0.9cm，头尾两端平行于脊柱各标记一直径1.8cm，面积2.54cm<'2>的圆形切口线。经消毒铺巾后，用手术刀沿标记线切除全层皮肤至深筋膜，形成4个圆形创面。 4 给药方法：对照组、CTS组、bFGF组、CTS+bFGF组分别用蒸馏水、CTS、bFGF、CTS+bFGF药液浸透双层纱布覆盖创面，再盖以凡士林油砂，无菌纱布包扎，绷带固定，每日换药一次。 5 取材：每组动物分为4组，每组3只，分别于术后第3、7、10、14天切取原创伤范围内组织。所取组织中用4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，分别行常规HE染色、Massoll染色和免疫组化染色。 6 观测指标 6．1创面大体观察：每日换药时肉眼观察创面炎症反应。 6．2创面愈合时间：以创面面积小于总面积的5％或愈合面积大于95％为完全愈合。 6．3创面愈合率的观察：各组动物分别在伤后第3、7、10、14天，用0.25×0.25的透明方格纸测定伤口面积，用德国产ASM-68K半自动图像分析仪计算伤口面积。伤口愈合速率=愈合面积/原伤口面积×100％。 6．4光镜组织学观察：HE染色和Masson染色后，观察术后第3、7、10、14天组织中新生毛细血管，胶原纤维以及细胞渗出的变化。 6．5胶原纤维面密度(area density on area，AA)：Masson染色组织切片，在肉芽组织中央浅部、中央深部、两侧部各随机选取5个视野，利用计算机辅助病理图像分析系统计算绿染的胶原纤维的面密度，结果取均数。 6．6血管内皮生长因子(Vasctllar Endothelial GrowthFactor,VEGF)免疫组化染色切片：光镜观察血管内皮生长因子分布部位和表达。采用Motic Med6.0数码医学图像分析系统进行定量分析，每组选4张切片，每张切片选取有代表性区域，随机取互不重叠的5个200倍视野，以光密度200为背底，彩色摄像机取图，测量平均光密度和积分光密度值并用计算机进行统计学处理。 6．7-氧化氮合酶(nitric oxide syntlaase，NOS)免疫组化染色切片，光镜观察NOS分布部位和着色深浅程度。在200倍光镜下随机选5个视野，计算总细胞数和阳性细胞数，并计算阳性细胞率。 7 统计学处理：用SPSS13.0统计处理软件，对各种数据进行处理。 结果 1 创面大体观察：伤后早期对照组创面肿胀、渗出及创周红肿最为明显，CTS组、bFGF组依次次之，CTS+bFGF组最轻，各组均未感染。 2 创面愈合时间的观察：对照组为15.28±0.6419天、CTS组为14.02±0.4817天、bFGF组为12.50±0.6245、CTS+bFGF组为10.24±0.4827天，四组有非常显著性差异(单向方差分析，F=74.23，P(0.01)。CTS+bFGF组愈合天数明显短于CTS组、bFGF组和对照组(P<0.01)。 3 创面愈合率的观察：从附表2可见，CTS+bFGF组创面愈合率高于bFGF组、CTS组以及对照组，四组有显著性差异(重复测量方差分析，F=410.36，P<0.05)，两两比较有非常显著性差异(P<0.01)；愈合率随时间推移明显升高(F=637.86，P<0.01)，四个时间点两两比较有非常显著性差异(P<0.01)。组别与时间交互效应有显著性差异(F=44.54，P<0.05)。 4 光镜观察：CTS+bFGF组、CTS组以及bFGF组在创伤后第3天比对照组有较多毛细血管生成，创伤后14天成纤维细胞排列整齐。 5 胶原纤维面密度(AA)：四组均成持续性增加趋势，伤后四组有非常显著性差异(F=937.46，P<0.01)，CTS+bFGF组明显高于其它三组(P<0.01)，但对照组第与CTS组比较无统计学意义(P>0.05)；伤后3、7、10、14天之间，两两比较均有非常显著性差异(P(0.01)；组别与时间之间交互效应无统计学意义(F=2.49，P>0.05)。 6 VEGF免疫组化染色结果：四组大血管和新生毛细血管的内皮细胞均有阳性表达。对照组第3天和第14天分别呈现VEGF阳性颗粒表达高峰。而CTS组VEGF表达则在第7天达到高峰，之后缓慢下降。CTS+bFGF组和bFGF组在伤后第10天达到最高，至伤后第14天仍保持较高水平。伤后四组两两比较有非常显著性差异(F=1217.35，P<0.01)，CTS+bFGF组明显高于其它三组(P<0.01)；伤后3、7、10、14天之间，两两比较均有显著性差异(P<0.05)；组别与时间之间交互效应有统计学意义(F=48.12，P<0.05)。 7 NOS在创面组织中的表达：皮肤中角质形成细胞、汗腺和骨骼肌细胞以及创伤后肉芽组织的炎症细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞均可表达NOS蛋白。伤后四组两两比较有非常显著性差异(F=234.45，P<0.01)，CTS+bFGF组明显高于其它三组(P<0.01)；四个时间点之间有非常显著性差异(F=65.14,P<0.01)，两两比较均有统计学意义(P<0.05)；组别与时间之间交互效应有统计学意义(F=125.31，P<0.05)。 结论：CTS和bFGF均能促进细胞增殖分化，刺激肉芽组织生长，加速伤口愈合；CTS+bFGF促进伤口愈合优于单用CTS和单用bFGF，并且能缩短愈合过程，提高愈合质量。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图一

附图二

附表

讨论

结论

参考文献

综述：壳多糖和碱性成纤维细胞生长因子对伤口愈合的影响

致谢

个人简历