甲状腺相关眼病眼眶前脂肪细胞的诱导分化及原子力显微镜下的形态学观察

摘要

目的：研究眼眶前脂肪细胞原代培养及诱导分化的方法并对其进行鉴定；探索利用原子力显微镜(Atomic forcemicroscopy，AFM)观察人眼眶前脂肪细胞的最佳方法；利用AFM观察甲状腺相关眼病(Thyroid-associatedOphthalmopathy，TAO)患者和正常眼眶前脂肪细胞膜表面的形态学异同，利用AFM观察TAO患者和正常眼眶前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞过程中细胞膜表面的形态学异同；并探讨其可能的分化和发病机制。 方法：①TAO患者手术切除的15例眼眶脂肪组织培养所获的前脂肪细胞作为实验组，眼眶良性肿瘤手术中切除的15例正常脂肪组织培养所获得的前脂肪细胞作为正常对照。 ②采用组织块培养法和胶原酶消化法分离培养TAO患者及正常眼眶前脂肪细胞，对细胞形态学进行观察；通过MTT法观察前脂肪细胞活力及生长状况；加入适当的诱导分化因子，观察人眼眶前脂肪细胞的增殖与分化过程；通过使用油红O对细胞进行染色，观察诱导分化前后细胞脂质含量的变化；免疫细胞化学方法检测细胞分化不同时期S-100蛋白的表达情况。 ③采用不同浓度戊二醛溶液对细胞进行固定，摸索出适合AFM扫描的最佳固定浓度；用AFM观察TAO与正常眼眶前脂肪细胞膜表面的形态学特点；甩AFM观察分别在诱导分化的第2，8，16d TAO与正常眼眶前脂肪细胞膜表面形态学差异。 结果：①使用组织块培养法和酶消化培养法从TAO患者和正常眼眶脂肪组织中均分离培养出大量螺旋状生长的长梭形细胞。相较组织块培养法，酶消化法得到的细胞纯度高，数量多，细胞形态好，适合于AFM标本的制备。 ②使用酶消化法得到的前脂肪细胞特点：来源于脂肪组织，长梭形；生长曲线为“S”形，第3-11d为对数生长期；免疫细胞化学S-100蛋白表达弱阳性；诱导分化2d后细胞出现微小脂滴，脂滴数量逐渐增多，至分化第16d到达高峰，可被油红O染为红色，S-100蛋白表达阳性细胞数增加。 ③使用AFM观察TAO患者及正常眼眶前脂肪细胞。发现扫描范围为80μm 时两种细胞均为长梭形，细胞均直径＞80μm，未观察到明显的差异。扫描范围为1μm时两种细胞表面出现大小不等的颗粒状物质，TAO患者细胞膜表面相对粗糙，隆起结构起伏较大，排列疏密不均，其平均粗糙度为36.480±8.146nm；正常前脂肪细胞膜表面相对光滑，隆起结构起伏较小，排列疏密均匀，其平均粗糙度为32.189±7.819nm；相比较两组细胞膜粗糙度，TAO组较对照组粗糙度明显增加(p＜0.01)。 ④使用AFM观察TAO患者及正常眼眶前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞的过程。发现扫描范围为80μm时，随着分化时间延长，细胞形态均由梭形变为多角形再变为椭圆形。扫描范围为1μm时，分化第2，8，16d两种细胞表面出现较密集的颗粒状物质，随着分化时间的延长，细胞膜表面粗糙变大，隆起变高，至16d达到高峰；TAO患者前脂肪细胞在同一时间膜表面粗糙度均大于正常细胞(p<0.05)。 结论：①酶消化法较组织块法所得到的前脂肪细胞数量更多，纯度更高。②前脂肪细胞在体外可被诱导分化为脂肪细胞。③S-100蛋白表达水平可作为评价出现脂滴多少的指标。④AFM可以清楚直观的观察到TAO患者及正常眼眶前脂肪细胞膜的微观结构及三维成像情况，是一种较好的观察细胞膜表面微观形态的工具。⑤TAO患者前脂肪细胞较正常细胞膜表面粗糙；分化过程中，TAO患者及正常膜表面粗糙度增加，同一时间，TAO患者前脂肪细胞膜粗糙度显著大于正常细胞。

目录

声明

摘要

引言

第一部分甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞的分离培养和诱导分化

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分甲状腺相关眼病患者眼眶前脂肪细胞的原子力显微镜的形态学观察

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 甲状腺相关眼病中的脂肪细胞分化

致谢

个人简历