褪黑素对内毒素致大鼠急性肺损伤中p38MAPK信号通路的影响

摘要

目的：急性肺损伤(acute lung iniury，ALI)是临床常见的由感染等多种因素引起的弥漫性肺实质损伤，也是全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)或多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)在肺部的典型表现。ALI的发病的机制很复杂，迄今为止尚未完全阐明。以往的研究己证明，ALI的发生与机体肺部氧化/抗氧化平衡失调有直接关系，因为当肺脏受到各种致病因素(如创伤、休克、感染等)严重打击时，可导致肺脏局部产生剧烈的氧化应激反应，进而引起ALI。革兰氏阴性菌是临床引起气道和肺部炎症的重要病原之一，其脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)成分介导炎症细胞如肺泡巨噬细胞、中性粒细胞以及内皮细胞等释放大量的促炎因子、炎性介质，此过程在炎症反应中起重要作用。然而，在炎症反应过程中，信号转导系统起着至关重要的作用。 促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)介导的信号转导通路是生物信号引起核反应的重要通路，其家族主要有细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK.)、c-jun氨基未端激酶(c-Jun-NH2-terminal kinase，JNK)、p3 8MAPK和ERK-5。其中p38MAPK信号通路与ALI关系密切，是参与炎症反应的细胞内的重要通路，p38MAPK通过非磷酸化转化为磷酸化状态进而促进下游底物的磷酸化以实现信号转导，启动核因子-kB(nuclear factor-kB，NF-kB)、激活蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)等转录因子，从而促进炎症介质分泌，介导炎症反应。但是，关于p38MAPK信号通路活化及上游调控机制仍不清楚。实验表明，p38MAPK通路对机体有保护性作用。但由于TNF-α、IL-1持续高水平而导致的炎性过程可能同p38MAPK的过度激活有关，尤其在LPS诱导的多种细胞因子合成的信号转导中起到关键性作用。Beaty等实验表明p38MAPK途径介导了LPS作用的中性粒细胞内的信号转导，p38MAPK在LPS作用下被磷酸化活化，活化的p38MAPK即由胞浆进入胞核，转录生成大量的炎性因子。有研究已证明抑制p38MAPK途径，能够有效的抑制炎症反应，明显的减轻机体的炎症反应。褪黑素是已发现的具有强抗氧化应激作用的激素，但其作用与p38MAPK途径是否相关，国内外无相关文献报道，其机制尚有待研究。 褪黑素最早认为对机体的生殖系统、内分泌系统、精神神经系统和生物节律等都有明显的调节作用，同时与睡眠、镇静等生物学行为有关。直到20世纪90年代初，Tan等首次报道MT具有抗氧化活性，是一种高效的内源性自由基清除剂，并在抗炎方面有积极的作用，所以，MT抗ALI机制研究仍然是目前的热点。但是，MT抗氧化抗炎作用的信号转导途径、生理水平MT在机体抗氧化抗炎防御体系中的地位和机制到目前仍未弄清楚，所以从分子水平去解决上述问题，为MT的广泛应用开辟更为广阔的前景。本课题通过气管内滴注LPS复制大鼠ALI模型，旨在在体实验探讨ALI和p38MAPK信号通路活化的关系及MT抗ALI机制，为MT的临床应用提供一定的理论和实验依据。方法：本实验采用气管内滴注LPS复制大鼠ALI模型，并通过腹腔给予MT，观察不同时间点丙二醛(malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)、肺组织病理学改变及肺组织中p38MAPK蛋白的表达变化。 将72只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重190～220克，随机分为3组，每组24只。①Control组：经气管滴注无热源生理盐水(NS)，每只200μl，并在滴注前后30min分别腹腔注射(ip)溶媒(1％乙醇生理盐水)1ml/kg；②LPS组：经气管滴注LPS(200μg/200 μl/只)，并在滴注前后30min分别ip溶媒1ml/kg；③LPS+MT组：经气管滴注LPS(200μg/200μl/只)，并在滴注前后30min分别ip MT 10mg/kg。各组动物分别于滴注LPS后3h、6h和10h经颈总动脉放血处死，同时留取肺部标本。肺部标本分为三部分：一部分制备匀浆检测MDA、SOD、NO的活性和含量变化；一部分观察其形态学变化，同时采用免疫组织化学染色和图像分析观察肺组织中p38MAPK蛋白的表达和分布；另一部分匀浆采用Westernblot技术观察肺组织中p38MAPK蛋白的表达变化。 数据均以均数±标准差((ˉx)±s)来表示，组间差异用单因素方差分析(one way ANOVA)，有显著差异者用SNK-q检验进行两两比较，均以P＜0.05为有统计学意义。 结果：1 肺组织中MDA含量的变化：与Control组相应时间点比较，LPS组经气管内滴注LPS后3h、6h和lOh肺组织中MDA含量显著升高(P均＜0.01)，且10h时达到高峰，相邻时间点之间有显著差异(P均＜0.01)：与LPS组相应时间点比较，LPS+MT组肺组织MDA含量明显降低(P均＜0.01)，但仍高于Control组(P均＜0.01)。 2 肺组织中SOD活性的变化：与Control组相应时间点比较，LPS组经气管内滴注LPS后3h、6h和10h肺组织中SOD活性显著降低(P均＜0.01)，且10h时活性降到最低，相邻时间点之间有显著差异(P均＜0.01)；与LPS组相应时间点比较，LPS+MT组肺组织SOD活性明显升高(P均＜0.01)，但仍低于Control组(P均＜0.01)。 3.肺组织中NO含量的变化：与Control组相应时间点比较，LPS组经气管内滴注LPS后3h、6h和10h肺组织中NO含量显著升高(P均＜0.01)，且10h时达到高峰，相邻时间点之间有显著差异(P均＜0.01)；与LPS组相应时间点比较，LPS+MT组肺组织NO含量明显降低(P均＜0.01)，但仍高于Control组(P均＜0.01)。 4 肺组织形态学观察：Control组肺泡结构清晰，壁薄，肺泡腔内无渗出液；滴注LPS后3h肺泡间隔明显增厚，肺泡萎陷及炎细胞浸润，6h时其结构已无法辨认，10h时改变更加显著；LPS+MT组3h改变同Control组，6h与10h时肺泡结构仍然存在，肺泡间隔略增厚，PMN浸润较LPS组明显减轻，肺泡腔内渗出不明显，但个别区域炎症改变较突出。 5 肺组织免疫组织化学染色观察：Control组气道和肺组织可见反应较弱的p38MAPK阳性细胞，LPS组p38MAPK阳性细胞较对照组明显增多(10h时表达达到高峰，P＜0.05或P＜0.01)，主要分布于浸润的炎症细胞、气道上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞。LPS+MT组气道和肺组织中阳性细胞分布与LPS组类似，但阳性信号明显减弱(10h时P均＜0.01)。 6 肺组织Western blot分析发现：Control组可见肺组织p38MAPK蛋白有少量表达。LPS组各时间点与Control组相比，p38MAPK蛋白表达显著升高，10h时达到高峰，表现为p38MAPK与β-actin的IOD值的比值升高(P＜0.05或P＜0.01)。LPS+MT组各时间点与LPS组相比，p38MAPK蛋白表达下降，表现为p38MAPK与β-actin的IOD值的比值下降(P均＜0.05)，但仍高于Control组。 结论：1 气管内滴注LPS可引起大鼠肺组织严重的炎症反应，说明成功地复制了ALI动物模型。 2.LPS诱发的大鼠急性肺损伤模型中，磷酸化p38MAPK在气道和肺组织内表达增加，p38MAPK的活化见于肺组织内多数细胞，提示肺内炎性和非炎性细胞均有p38MAPK信号分子的激活。 3.MT对ALI时的肺脏起明显的保护作用，其保护机制可能与MT的抗氧化作用和抑制p38MAPK信号通路的过度激活有关。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述：褪黑素的研究进展

致谢

个人简历