类风湿性关节炎患者外周血IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-4和IL-10基因甲基化状态研究

摘要

目的：类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)属自身免疫性疾病，发病机制尚不明。本研究论文以Th1、Th2、Treg、Th17相关细胞因子平衡失调为切入点，通过检测类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞Th1型细胞因子如IL-1β、TNF-α和IFN-γ，Th2型细胞因子如IL-4和IL-10，Treg型细胞因子IL-10和Th17型细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-17的甲基化状态与mRNA表达的关系，分析甲基化与类风湿性关节炎的相关性，筛选对RA早期诊断具有借鉴意义的甲基化指标；进而通过5-azaC、Hcy处理体外培养的RA患者外周血单个核细胞，观察对这些指标的甲基化逆转和基因表达调节作用，探讨RA发生发展中可能的表遗传学机制，对早期诊断、评价病程发展提供借鉴，为治疗寻找新的靶点提供实验依据。 方法： 1.观察类风湿性关节炎患者外周血Th1、Th2、Treg、Th17相关细胞因子平衡失调状态收集处于活动期的类风湿性关节炎患者，符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿性关节炎诊断标准，并根据2003年欧洲抗风湿病联盟会议对早期RA的定义，将病程在2年之内(含2年)的RA定义为早期RA，有34例，非早期RA 30例。男:女=1:3，并记录相关临床资料。采集性别和年龄匹配的健康志愿者作为对照组。密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，RT-PCR、ELISA法分别检测外周血单个核细胞Th1、Treg、Th17型细胞因子mRNA及血清中蛋白表达，并与疾病活动性指标进行相关性分析，观察不同病程阶段RA患者外周血中Th1、Th2、Treg和Th17细胞相关细胞因子的动态变化趋势，分析各细胞因子表达变化与疾病进展的关系，初步探讨RA炎症进展的机制。 2.类风湿性关节炎相关炎症因子基因甲基化提取单个核细胞DNA，进行亚硫酸氢钠修饰，发生甲基化的DNA在修饰后序列不发生改变，未发生甲基化的DNA在修饰后CpG中5’端的“C”全部转换成“U”，根据修饰后DNA序列的不同，运用在线MethPrimer软件设计引物，甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测RA病人和健康个体上述细胞因子启动子甲基化状态。分别选取各基因甲基化PCR和非甲基化PCR产物测序。分析启动子甲基化与其mRNA表达之间的相关性，并分析甲基化与疾病活动性指标的相关性，筛选对RA早期诊断具有借鉴意义的甲基化指标，探讨DNA甲基化在RA发生发展中的作用。 3.观察甲基转移酶抑制剂5.氮杂胞苷对IL-10、IL-4的甲基化逆转作用，进一步证实DNA甲基化与基因表达间的关系我们选用筛选出的在RA存在异常高甲基化的IL-10、IL-4基因作为研究对象，以5-氮杂胞苷处理体外培养的RA患者外周血单个核细胞，采用MSP方法检测5-氮杂胞苷不同剂量、不同作用时间对IL-10、IL-4基因甲基化状态的逆转作用，RT-PCR、ELISA法检测5-氮杂胞苷处理前后IL-10、IL-4 mRNA和蛋白表达变化，采用染色质免疫共沉淀技术检测药物处理前后IL-10启动子与磷酸化CREB结合活性变化，焦磷酸测序方法对药物处理前后IL-10启动子区5个CpG位点甲基化进行定量检测，分析不同位点甲基化与转录的关系；同时RT-PCR检测药物处理前后甲基化特异性结合蛋白MeCP2、DNA甲基转移酶DNMT1和DNA去甲基化酶mbd2的mRNA表达变化，探讨5-氮杂胞苷对RA外周血IL-10、IL-4基因甲基化逆转及调节基因转录的机制。 4 观察同型半胱氨酸对IL-1β、TNFα和IL-17基因甲基化及表达的影响选用筛选出的在RA存在异常低甲基化的IL-1β、TNFα和IL-17基因作为研究对象，以同型半胱氨酸处理体外培养的RA患者外周血单个核细胞，MSP方法检测同型半胱氨酸不同剂量、不同作用时间对IL-1β、TNF-α和IL-17基因甲基化状态影响，RT-PCR、ELISA法检测IL-1β、TNFα和IL-17 mRNA和蛋白表达的变化，同时RT-PCR法检测MeCP2、DNMT1和mbd2的mRNA表达变化。 5 遗传学调查采集7例真父-子-母三联体家系外周血，提取基因组DNA，经亚硫酸氢钠处理后，MSP方法检测IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17基因甲基化状态，分析基因甲基化在世代之间传递的规律，初步探讨甲基化发生的机制。 结果： 1.活动期RA患者外周血单个核细胞IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17 mRNA表达和血清中蛋白表达水平均高于健康对照组(P<0.05)，IL-4、IL-10mRNA和血清中蛋白表达水平均低于健康对照组(P<0.05)。早期RA患者IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17 mRNA和蛋白表达高于非早期RA患者，随病程延长，RA患者血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17蛋白表达呈下降的趋势；早期RA患者IL-4、IL-10 mRNA、蛋白表达低于非早期RA患者，IL-4 mRNA与病程呈正相关(r=0.468，P<0.05)，随病程延长，RA患者血清中IL-4、IL-10蛋白表达呈逐渐升高趋势。IL-17 mRNA与所累关节数呈正相关(r=0.581，P<0.05)，IFN-γmRNA、蛋白表达与ESR呈正相关(r=0.466，P<0.05)(r=0.471，P<0.05)。 2.IL-1β、IL-10、TNF-α、 IL-17基因启动子甲基化状态与其mRNA表达呈负相关(r=-0.401，P<0.05) (r=-0.579，P<0.01) (r=-0.452，P<0.05)(r=-0.414，P<0.05)。IFN-γ、IL-4基因启动子甲基化状态与其mRNA表达无相关性(r=-0.017，P>0.05)(r=-0.154，P>0.05)。IL-10启动子甲基化与所累关节数显著相关(r=0.679，P<0.05)，IL-17启动子甲基化与血沉(ESR)、类风湿因子(RF)显著相关(r=-0.646，P<0.01)(r=-0.601，P<0.05)。 3.与健康组比较，IL-10基因在RA组存在较高频率的甲基化(85.29％ vs43.33％,P<0.05)，IL-1β、TNF-α、IL-17基因在RA组中甲基化率较低，而在相应健康组存在较高频率的甲基化(33.33％ vs 82.61％，6.67％ vs 50％，46.67％ vs 85.42％；P<0.05)，IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-17基因甲基化状态对临床早期诊断具有一定的借鉴意义。 4 1μmol/L 5-azaC对IL-4、IL-10启动子甲基化状态逆转不明显，5μmol/L、10μmol/L 5-azaC的逆转甲基化作用显著，可以显著逆转IL-10启动子-62、-41、-39、-9 CpG位点高甲基化状态，+222 CpG低甲基化状态改变不显著，并且1μmol/L、5μmol/L 5-azaC使IL-4、IL-10 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)，10μmol/L 5-azaC使其表达下降。5μmol/L 5-azaC可以使P-CREB与IL-10启动子结合活性升高(P<0.05)。 5 200μmol/L Hcy可介导IL-1β、TNF-α、IL-17启动子甲基化，并抑制基因表达(P<0.05)。50μmol/L、100μmol/L Hcy对IL-1β、TNF-α、IL-17启动子甲基化状态影响不明显，使IL-1β、TNF-α、IL-17 mRNA表达量增加。 6 5-azaC可使mbd2 mRNA表达升高(P>0.05)，使MeCP2、DNMT1 mRNA表达下降(P>0.05)。Hcy可使mbd2 mRNA表达下降(P>0.05)，MeCP2、DNMT1 mRNA表达量增加(P>0.05)。IL-4、IL-10、IL-1β、TNF-α、IL-17启动子甲基化、mRNA表达与mbd2、MeCP2、DNMT1 mRNA表达量均无相关性(P>0.05)。 7 健康家系调查结果显示，IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17启动子甲基化在父、母与子代之间不符合孟德尔遗传规律，并且与遗传印记基因的亲源依赖性遗传方式亦不相同。 结论： 1.早期RA患者外周血中Th1和Th17型细胞因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17)占优势，非早期RA患者外周血中Th2和Treg型细胞因子(IL-4、IL-10)占优势，随着病程延长IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17表达逐渐下降，IL-4、IL-10表达逐渐升高，与RA活动有关。表明在初次发病及不同病程阶段，RA患者外周血中Th1/Th2、Treg/Th17型细胞因子存在不同的失衡状态。 2.早期RA患者IL-10基因呈高甲基化，IL-1β、TNF-α和IL-17基因低甲基化，DNA甲基化通过调控Th1/Th2、Treg/Th17型细胞因子失衡，参与了RA早期炎症状态的发生、发展，其甲基化状态对RA早期诊断具有一定的借鉴意义。 3.IL-10启动子区上游的CpG位点(-62、-41、-39、-9)可能是调控其转录的关键序列。 4 通过5-azaC和Hcy可逆转体外培养的PBMCs炎症相关基因甲基化，恢复或抑制基因表达，为建立自体细胞体内回输治疗RA提供了实验依据。

目录

论文说明：英文缩写

声明

摘要

引言

第一部分类风湿性关节炎患者外周血IL-1β、TNF-α、IL-17、IL-10、IL-4和IFN-γ的检测分析

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分类风湿性关节炎相关炎症因子基因甲基化

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分5-氮杂胞苷对IL-10、IL-4基因甲基化逆转及调节基因表达的机制研究

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第四部分同型半胱氨酸对IL-1β、TNF-α和IL-17基因甲基化及表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

第五部分遗传学调查

前言

材料与方法

结果

附图、附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 表遗传学与自身免疫性疾病

致谢

个人简历