A族链球菌表面蛋白Fba单克隆抗体对应表位的鉴定及研究

摘要

目的：A族链球菌（GAS）是一种常见致病菌，可引起严重的侵袭性感染及感染后变态反应性疾病。青霉素一直是抗链球菌感染的首选药物，但随着抗菌药的大量应用、乃至滥用，耐药菌株逐渐增多，加之链球菌本身的免疫逃逸，链球菌感染在临床上仍然呈现反复性及难以治愈的问题。诱导产生高效价抗体仍然是预防、控制链球菌感染的有效措施，故疫苗的研制成为预防此菌感染的又一切入点。但由于GAS血清型众多及其表面某些免疫原性强的蛋白可诱导严重的自身免疫反应等弊端，目前还没有理想的疫苗问世。本研究以McAb2结合Fba蛋白的特异性区段为基础，利用生物信息学方法预测McAb2所对应的表位，借助基因工程手段获取了含有相应表位的融合蛋白及预期表位缺失蛋白，并利用噬菌体肽库筛选McAb2结合的关键位点，进而对该结合位点是否与FH和Fba蛋白的结合位点相重叠进行了研究。为进一步探索Fba蛋白在GAS致病机制中的作用，鉴定McAb2的功能及制备表位肽疫苗奠定了基础。
　　 方法：⑴针对McAb2结合Fba蛋白的特异区段，利用生物信息学方法预测其所对应的表位，确定涵盖此表位的三个重叠表位片段，采用搭桥PCR扩增该基因片段并克隆表达，Western blot检测融合蛋白与McAb2的结合。⑵构建相应表位缺失的基因片段并克隆表达，Westernblot及ELISA检测突变蛋白与McAb2是否结合。⑶合成表位重叠肽片段，dot-ELISA检测各段与McAb2的结合。⑷利用噬菌体7肽库筛选McAb2对应的优势氨基酸。⑸通过竞争ELISA检测McAb2是否能竞争FH与Fba蛋白的结合。⑹利用血浆吸附实验[5]检测McAb2能否阻止人血浆中的FH与Fba蛋白结合。
　　 结果：①成功构建了pGEX-4T-2与预测的三条基因片段84～101aa、95～114aa、101～118aa的原核表达质粒，并分别得以表达。Western blot结果显示，Fba95-114和Fba101-118与McAb2有明显的杂交带。②成功构建表位缺失的基因片段68～161aa△96～118aa与pGEX-4T-2的重组原核表达质粒，并得以成功表达。Western blot显示McAb2不与Fba68-161△96-118结合。间接ELISA结果与上述结果一致。③合成三段重叠肽分别是Fba蛋白的第100～112、104～116和108～120位氨基酸多肽，dot-ELISA结果显示第100～112位的氨基酸多肽与McAb2的结合能力最强。④利用随机噬菌体7肽库筛选的结果显示McAb2针对的优势氨基酸是位于Fba基因序列的第100～110位氨基酸中的ITPDL。⑤竞争EIASA数据经统计学处理，证实McAb2能部分封闭FH与野生型GAS的结合。⑥血浆吸附实验证实野生型GAS能结合人血浆中的FH，并且McAb2可以部分阻止FH与Fba蛋白的结合。
　　 结论：⑴成功克隆、表达了Fba蛋白McAb2所对应的表位肽段及预期表位缺失蛋白，初步确定了McAb2对应的表位区段。⑵利用噬菌体展示技术，确定了McAb2所针对的优势氨基酸。⑶McAb2能够阻止或部分阻止FH与Fba蛋白的结合，为进一步鉴定McAb2的功能，深入研究GAS的致病机制提供了有力的依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 McAb2对应表位的初步定位

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

第二部分 应用噬菌体肽库筛选McAb2对应的优势氨基酸

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

第三部分 McAb2封闭Fba蛋白与FH结合位点的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

参考文献

综述 浅谈多肽疫苗

致谢

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